Особенности экспрессии термогенина в жировой ткани сердца пациентов с атеросклерозом коронарных артерий

За последние два десятилетия представления о жировой ткани (ЖТ) существенно эволюционировали от простого депо для хранения липидов до метаболически активного эндокринного органа, участвующего в регуляции метаболизма липидов и глюкозы, чувствительности к инсулину, реакций воспаления, функции сосудис­того эндотелия, термогенеза [1]. На сегодняшний день роль висцеральной ЖТ (ВЖТ) в развитии сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) является неоспоримой. Именно ремоделирование и дисфункциональные нарушения в висцеральном депо, а не в подкожной ЖТ (ПЖТ), ассоциированы с развитием ССЗ. В связи с чем именно распределение ЖТ, ее молекулярно-генетические особенности в зависимости от анатомического расположения, а не общее количество ЖТ, оцениваемое по индексу массы тела (ИМТ), являются ключевыми факторами, определяющими высокий сердечно-сосудистый риск [2][3]. Говоря о ССЗ, особое значение имеют ВЖТ эпикардиальной локализации (ЭЖТ), расположенная между миокардом и висцеральным перикардом, и периваскулярная ЖТ (ПВЖТ), расположенная вдоль коронарных артерий (КА), не имеющие анатомических барьеров с миокардом и сосудистой стенкой, благодаря чему оказывают эффекты на нижележащие структуры [4].

Согласно данным клинических исследований увеличение размеров ЭЖТ является доказанным фактором риска развития ССЗ, а также предиктором будущих коронарных событий независимо от других факторов риска ССЗ и ИМТ [5]. Однако не только количество ЖТ, но и ее молекулярно-генетические изменения и морфофункциональные особенности играют ключевую роль в патогенезе ССЗ, которые ассоциированы с типом ЖТ (белая и бурая ЖТ) [6][7]. Белые адипоциты являются основной массой клеток как в ВЖТ, так и в ПЖТ. Бурая ЖТ составляет всего ~4,3% от всей ЖТ у взрослых людей, в отличие от белой ЖТ хорошо васкуляризирована и иннервирована [8][9]. Отличительной особенностью бурых адипоцитов является экспрессия белка термогенина (разобщающий белок 1/UCP1), за счет которого реализуется основная функция адипоцитов этого типа — недрожательный термогенез [1][8]. Помимо классических бурых адипоцитов, описан еще один тип буроподобных адипоцитов — "бежевых" ("BRITE-адипоциты"), имеющих схожие метаболические характеристики с бурыми адипоцитами [9]. Хроническое воздействие экологических факторов, диета с высоким содержанием жиров, патофизиологические стимулы могут вызывать ремоделирование ЖТ и модулировать программирование адипоцитов, меняя их функциональные характеристики с изменением бурого фенотипа на белый. В то же время количество бежевых и бурых адипоцитов может увеличиваться в ответ на низкие температуры и активацию β-адренергических рецепторов (β3-АР) либо при введении агонистов этих рецепторов, регулярных занятий спортом, диете с высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот и других воздействиях. Этот процесс также называется "потемнение" белой ЖТ или адаптивный термогенез. В результате в адипоцитах наблюдается сверхэкспрессия термогенных генов и белков [8]. При прекращении внешних стимулов адипоциты обратно приобретают фенотип белого жира с отсутствием экспрессии UCP1 [6].

Многочисленные данные свидетельствуют о том, что ЭЖТ в значительной степени представлена адипоцитами экспрессирующими UCP1 [10-12], также термогенин обнаружен и в ПВЖТ, экспрессия которого зависит от анатомического расположения ЖТ [12][13]. На сегодняшний день нет никакого сомнения, что ЖТ сердца является одним из основных источников UCP1-положительных адипоцитов в организме взрослого человека. Однако функциональная значимость UCP1 в ЖТ сердца остается в значительной степени неизвестной. В физиологических условиях коричневая и бежевая ЖТ в основном ассоциируется с положительными эффектами на сердечно-сосудистую систему, однако значимость термогенного фенотипа ЭЖТ и ПВЖТ остается предметом дискуссий при патологических состояниях [13]. Кроме того, большинство исследований, оценивающих связь между экспрессией UCP1 и ССЗ, были проведены преимущественно на грызунах, клинические исследования на сегодняшний день немногочисленны. В связи с чем целью данного исследования явилась оценка термогенного потенциала ЭЖТ и ПВЖТ среди пациентов с коронарным атеросклерозом и без него.

Материал и методы

Исследование проведено на базе ФГБНУ НИИ "Комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ). В исследование были включены пациенты со стабильной ишемической болезнью сердца (ИБС, n=7), имеющие показания для проведения прямой реваскуляризации миокарда методом коронарного шунтирования. В качестве группы сравнения — пациенты с приобретенными неревматическими пороками сердца (стеноз/недостаточность аортального и митрального клапанов, n=7), которым показана операция на клапанах сердца. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом НИИ КПССЗ. Обязательным условием включения в исследование было согласие пациента и подписание добровольного информированного согласия. Критерии исключения: отказ от проведения исследования, возраст пациентов старше 75 лет, наличие клинически значимой сопутствующей патологии. Во время оперативного вмешательства на сердце у каждого пациента были получены образцы ЭЖТ (из правых отделов сердца), ПВЖТ (из области правой КА), а также ПЖТ (подкожная клетчатка нижнего угла средостенной раны). Образцы ЖТ промывали в физиологическом растворе и замораживали в металлической форме с криогелем Tissue-Tek (4583, Sakura) в жидком азоте и хранили при температуре -80 °C до момента дальнейшего исследования.

Иммунофлуоресцентное исследование. Криосрезы ЖТ готовили при помощи криотома (CryoStar NX50, Thermo Scientific) толщиной 5 мкм. До момента использования стекла хранили в пластиковых контейнерах при температуре -80 °C. Приготовленные срезы ЖТ фиксировали в 4% параформальдегиде, отмывали в трех сменах фосфатно-солевого буфера (В-60201, Пущинские лаборатории) с pH 7,4. Блокировку неспецифического связывания антител проводили путем инкубации с 1% солевым раствором бычьего сывороточного альбумина (Р091Е, ПанЭко). Далее срезы инкубировали с первичным антителом к термогенину (PA124894, Invitrogen 1:200). По истечении срока инкубации и отмывки в фосфатно-солевом буфере срезы окрашивали вторичными преадсорбированными антителами, конъюгированными с флюорофором Alexa Fluor 555 (ab150062, Abcam, 1:500). Контрастирование ядер производили с помощью солевого раствора 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл, D9542, Sigma-Aldrich). После отмывки в трех сменах фосфатно-солевого буфера с pH 7,4 срезы заключали в монтирующую среду ProLong Gold Antifade (P36930, Invitrogen). Визуализацию готовых микропрепаратов осуществляли с помощью конфокального микроскопа (LSM 700, Carl Zeiss) на увеличении ×400.

Статистический анализ. Статистическая обработка полученных результатов была проведена c использованием программы GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). Количественные признаки представлены в виде абсолютных значений (n) и относительных значений (%), количественные данные — в виде медианы и значений 25-го и 75-го квартилей Mе (Q25; Q75). Сравнение трех независимых групп проводили с помощью критерия Крускала-Уоллиса с поправкой Бонферрони, за критический уровень значимости принимали р≤0,013, двух независимых групп — с помощью критерия Манна-Уитни. Категориальные переменные сравнивались с использованием критерия хи-квадрат. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты

Пациенты с ИБС и приобретенными пороками сердца (ППС), включенные в исследование, были сопоставимы по возрасту и полу (табл. 1). Средний возраст пациентов с ИБС составил 63,45 (49,67;69,27) лет, в группе с ППС — 60,45 (47,65;67,16) лет. В обеих группах преобладали лица мужского пола. Среди пациентов с ИБС чаще встречались такие факторы сердечно-сосудистого риска, как курение, артериальная гипертензия, нарушения липидного обмена, характеризующиеся более высоким содержанием холестерина общего, липопротеинов низкой плотности и низким уровнем холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛВП) в сыворотке крови в сравнении с группой ППС. Пациенты с коронарогенной патологией имели случаи инфаркта миокарда, острых нарушений мозгового кровообращения в анамнезе и мультифокальный атеросклероз в отличие от пациентов с ППС. Пациенты с ИБС имели стенокардию II и III функционального класса (ФК), хроническую сердечную недостаточность I ФК, в то время как пациенты с ППС в большей степени — хроническую сердечную недостаточность II ФК. Систолическая функция левого желудочка была оценена по фракции выброса (ФВ) левого желудочка по Симпсону. Среди лиц с ИБС ФВ составила 53,52 (46,24;58,76)%, что соответствует сохранной ФВ, в группе ППС — 51,13 (42,34;54,32)%.

Медикаментозное лечение пациентов проводили согласно рекомендациям Минздрава России (2020) и Европейского общества кардиологов (2020) (табл. 1).

Наличие белка UCP1 в адипоцитах ЖТ сердца различной локализации было оценено методом иммунофлуоресцентного окрашивания, который показал, что экспрессия термогенина наблюдается во всех локусах ЖТ независимо от нозологии (рис. 1). Последующий количественный анализ процентов положительного окрашивания UCP1 и интенсивности окрашивания в образцах ЖТ пациентов с ССЗ позволил выявить особенности экспрессии белка в зависимости от локализации адипоцитов. Так, среди пациентов с ИБС адипоциты ПВЖТ характеризовались максимальным количеством UCP1, в сравнении с эпикардиальными и подкожными адипоцитами (рис. 2 А, Б). При этом уровень белка в адипоцитах ЭЖТ был значимо ниже относительно подкожных и периваскулярных адипоцитов (рис. 2 Б). В группе ППС закономерности экспрессии термогенина отличались от пациентов с ИБС. В отличие от лиц с коронарным атеросклерозом в ПЖТ уровень термогенина имел минимальные значения относительно ЖТ эпикардиальной и периваскулярной локализации. В адипоцитах ЭЖТ и ПВЖТ экспрессия UCP1 была сопоставимой.

Сравнительный анализ белковой экспрессии UCP1 в зависимости от нозологии показал, что уровень термогенина в адипоцитах ЭЖТ пациентов с ИБС был значимо ниже в сравнении с ППС. На основании полученных данных можно предположить, что в ЖТ эпикардиальной локализации при ИБС наблюдается снижение адаптивного термогенеза, обусловленное снижением количества UCP1-положительных адипоцитов. В ЖТ периваскулярной локализации пациентов с коронарным атеросклерозом, напротив, уровень термогенеза сохранен на высоком уровне. Белковая экспрессия UCP1 в адипоцитах ПВЖТ пациентов с ИБС была выше таковой среди пациентов с ППС.

Корреляционный анализ показал наличие прямой корреляционной зависимости между процентом положительного окрашивания (R=-0,68, р=0,024), интенсивностью флуоресцентного окрашивания UCP1 (R=-0,65, р=0,029) в ЭЖТ пациентов с ИБС и содержанием ХС ЛВП в сыворотке крови. Также в группе ИБС обнаружена отрицательная корреляция слабой силы между интенсивностью флуоресцентного окрашивания UCP1 в ЭЖТ и ИМТ (R=-0,54, р=0,031).

Таким образом, коронарный атеросклероз ассоциирован с высокой белковой экспрессией термогенина в ЖТ окружающей КА, но не в ЖТ эпикардиальной локализации, которая характеризовалась минимальной экспрессией UCP1. ИБС характеризуется максимальным уровнем маркера термогенеза UCP1 в ЖТ подкожной локализации и в ЖТ окружающей сосуды сердца в сравнении с патологией клапанов сердца, чего не наблюдалось в ЭЖТ. В эпикардиальном локусе ЖТ при ИБС выявлены признаки ингибирования процессов термогенеза, что, вероятно, сопряжено с изменением фенотипа адипоцитов от бурого к белому.

Обсуждение

Согласно экспериментальным и клиническим исследованиям, экспрессия UCP1 обнаружена в ЭЖТ и ПВЖТ. Наличие бурого жира в перикардиальной области и парааортальных отделах у людей было впервые показано Джульет Хитон в 1979г, тогда как только в 2009г Sacks HS, et al. показали наличие маркеров бурых адипоцитов UCP-1, PRDM16 и PGC-1α в ЭЖТ пациентов с ИБС, экспрессия которых была выше, чем в ПЖТ [10]. В последствии другие исследования молекулярного профиля ЭЖТ также подтвердили эти данные [14-16]. Более того, уровень маркеров термогенеза в ЭЖТ среди пациентов с ИБС выше относительно уровня лиц без коронарной патологии. В другом исследовании уровень UCP1 был обнаружен только в ЭЖТ, но не в ПЖТ в области сердца или других исследуемых локусах среди лиц с коронарным атеросклерозом [17]. В ПВЖТ также обнаружены UCP1-положительные адипоциты. В ПВЖТ UCP1 необходим для регуляции сосудистого тонуса и накопления атерогенных липидов в сосудистой стенке [16][18]. Данное открытие подтверждает важную роль не только ЭЖТ, но и ПВЖТ в атерогенезе. Однако потенциальная роль термогенной регуляции в развитии ССЗ на сегодняшний день до конца не изучена.

Среди термогенных стимулов кроме холодового воздействия, диеты и активных спортивных тренировок идентифицированы множество других агентов. Сердечные натрийуретические пептиды являются индукторами потемнения в адипоцитах как мышей, так и людей [19]. Кроме того, бежевый адипогенез способны индуцировать врожденные лимфоидные клетки типа 2 (ILC2), активируемые интерлейкином 33 (ИЛ-33). ILC2 в ЭЖТ содержится большое количество, превышающее уровень в ПЖТ. ILC2-клетки генерируют ИЛ-13 и повышают секреторную способность эозинофилов с высвобождением ИЛ-4, оба цитокина индуцируют бежевый адипогенез [20]. Недавно показано, что внеклеточные везикулы ЖТ, являющиеся новым способом межорганной и межклеточной коммуникации между ЭЖТ и сердечно-сосудистой системой, которые включают экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца, также могут участвовать в потемнении белой ЖТ. Внеклеточные везикулы также включают микроРНК (miR). Показано, что некоторые из них играют важную роль в потемнении белой ЖТ. Например, miR-196a и miR-155 вызывают потемнение белой ЖТ во время воздействия холода и β-адренергической стимуляции [21].

Наличие UCP1-положительных адипоцитов в ЖТ сердца ассоциируют в большей степени с положительными эффектами. Термогенез и метаболически активный UCP1 влияют на локальный гомеостаз тканей, регулирует уровень жирных кислот, глюкозы, модулируют воспаление и окислительный стресс, влияют на экспансию ЖТ, и служат для защиты миокарда и коронарных сосудов от гипотермии, ишемии и гипоксии [10][14].

В пользу этой теории свидетельствуют также данные различных исследований. Так, у пациентов с ИБС выявлена прямая связь уровня UCP1 с содержанием ХС ЛВП в сыворотке крови и обратная взаимосвязь большинства генов, участвующих в термогенезе с циркулирующим уровнем триацилглицеридов [11]. В нашем исследовании также обнаружена прямая зависимость между уровнем белка UCP1 в ЭЖТ пациентов с ИБС и содержанием ХС ЛВП в сыворотке крови. В связи с чем трансдифференцировка адипоцитов от коричневых к белым может быть еще одним механизмом, посредством которого дисфункциональные изменения в ЖТ сердца и сосудов стимулируют прогрессирование атеросклероза. Однако в исследования Ahmadi N, et al. показано, что увеличение бурых адипоцитов в ЭЖТ относительно белых не связано с прогрессированием коронарного атеросклероза у лиц с ИБС [22]. Согласно другим данным стимуляция термогенеза в ЭЖТ и ПВЖТ приводит к активации бурого адипогенеза, снижению экспрессии провоспалительных цитокинов, в то время как нокдаун генов термогенеза приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли-α, ИЛ-1β, ИЛ-6, CCL2/MCP1), каждый из которых вызывает воспаление в ЖТ и эндотелии [23]. Показано, что более высокая экспрессия мРНК UCP1 в ЭЖТ может представлять собой защитный механизм против усиленной продукции активных форм кислорода (АФК) в условиях гипо­ксии и окислительного стресса при ИБС [15], в то время как увеличение АФК связано со сниженной экспрессией UCP1 и других маркеров термогенеза в ЭЖТ пациентов с ИБС [12].

Результаты, полученные в нашем исследовании, отчасти согласуются с полученными ранее. Мы показали, что уровень UCP1-положительных адипоцитов в ЭЖТ был минимальным среди лиц с ИБС как в сравнении с другими локусами ЖТ, так и в сравнении с пациентами без атеросклероза КА, что может свидетельствовать о сниженной способности ЭЖТ к адаптивному термогенезу и уменьшении количества бежевых и бурых адипоцитов, обусловленных локальным воспалением ЖТ, окислительным стрессом, высоким уровнем АФК. В то время как белковая экспрессия UCP1 в ПВЖТ пациентов с ИБС была максимальной в сравнении с другими локусами ЖТ и относительно лиц с ППС.

В исследовании Tang Y, et al., аналогично нашему, показано снижение экспрессии термогенных белков в ЖТ перикарда у пациентов с ИБС по сравнению с лицами без атеросклероза [24]. Согласно экспериментальным данным, прогрессирование атеросклероза ассоциировано с изменением фенотипа бурых адипоцитов в ЭЖТ на белый [16]. Kim S, et al. установили, что и ПВЖТ в области атеросклеротических бляшек может характеризоваться снижением экспрессии UCP1 на поздней стадии атеросклероза, что также может быть связано с процессом "отбеливания" ЖТ [25]. Некоторые физиологические процессы (например, старение) и патологические состояния (инсулинорезистентность) и заболевания (ожирение) могут способствовать "отбеливанию" ЖТ, при котором бурые и бежевые адипоциты трансдифференцируются в белые, а экспрессия UCP1 снижается. Подобная трансдифференцировка ассоциирована с повышенным образованием АФК у пациентов с ИБС, которые снижают функциональную активность кардиомиоцитов, в то время как транскриптом ЭЖТ характеризуется высоким уровнем маркеров воспаления [26]. В физиологических условиях в ЭЖТ, напротив, генерируется меньшее количество АФК, чем, например, в ПЖТ, однако при ИБС наблюдается обратная закономерность. Показано, что субпопуляция макрофагов, сосредоточенная вдоль симпатических нервных пучков в бурой ЖТ (симпатические нейрон-­ассоциированные макрофаги, CX3CR1+), способна подавлять термогенез [27]. Взаимодействие между макрофагами и адипоцитами через интегрин α4 и VCAM-1 ингибирует бежевый адипогенез и приводит к связанному с воспалением "отбеливанию" ЖТ [20]. Провоспалительные цитокины, продуцируемые резидентными иммунными клетками в ЖТ (фактор некроза опухоли, ИЛ-1β и др.) подавляют термогенез в ЖТ [20].

Таким образом, полученные нами результаты и литературные данные однозначно подтверждают наличие белковой экспрессии UCP1 в адипоцитах ЖТ сердца, уровень которой зависит от локализации ЖТ и наличия атеросклеротического процесса в КА. Вместе с тем результаты исследований на сегодняшний день демонстрируют неоднозначные данные относительно экспрессии термогенина в ЖТ данной локализации среди пациентов с ИБС. Дальнейшие исследования позволят идентифицировать роль эпикардиального и периваскулярного UCP1 в патогенезе атеросклероза и других ССЗ и механизмы регуляции его экспрессии. Принимая во внимание результаты современных исследований гипотеза о том, что UCP1-положительные адипоциты ЖТ сердца и сосудов могут служить терапевтической мишенью для модуляции функциональной активности ЖТ данной локализации, является жизнеспособной, однако необходимо более глубокое понимание термогенных свой­ств и их связи с процессом атерогенеза.

Ограничения исследования: 1) первым важным ограничением является сам дизайн исследования, в котором отсутствуют в качестве группы сравнения условно здоровые лица. Вследствие сложности получения образцов ЖТ у здоровых субъектов из изученных локусов ЖТ в исследование были включены пациенты с патологией клапанов сердца; 2) количество участников исследования; 3) наше исследование было сосредоточено на экспрессии UCP1, в то время как другие терморегуляторные молекулы (PRDM16, PGC-1α и PPARγ) также представляют большой интерес и требуют дальнейших исследований. Тем не менее нами была впервые оценена белковая экспрессия термогенина в ЭЖТ, ПЖТ, а также ПВЖТ, полученных от одного пациента как с атеросклеротическим поражением КА, так и без такового.

Заключение

В целом данные, полученные в ходе исследования, подтверждают гипотезу о защитной роли UCP1 в ЖТ окружающей КА при ИБС, в то время как в ЭЖТ пациентов с коронарным атеросклерозом кардиопротективные эффекты UCP1 снижены, что может быть обусловлено уменьшением количества UCP1-положительных адипоцитов и активацией адипогенеза белых адипоцитов. Регуляция термогенеза ЭЖТ и ПВЖТ при ССЗ может являться перспективной терапевтического тактикой по снижению объемов ЖТ, с одной стороны, и коррекции дисфункцио­нальных изменений в этих жировых депо, с другой стороны. Первые шаги в изучении регуляции термогенной активности ЖТ различными фармакологическими агентами (селективные β3-агонисты, гипогликемические препараты) в экспериментальных и клинических исследованиях демонстрируют положительные результаты, что открывает широкие перспективы по разработке эффективных стратегий лечения и профилактики ССЗ.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.