Клинико-нозологические детерминанты уровней зонулина и триметиламин N-оксида у пациентов с фибрилляцией предсердий

Контроль над традиционными факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний позволил добиться существенного прогресса в продлении жизни, однако смертность от сердечно-сосудистых заболеваний за период с 1990-2021гг увеличилась наполовину, а общая распространенность удвоилась [1], что подчеркивает необходимость поиска и изучения новых потенциальных факторов риска [2].

Современные научные исследования все чаще связывают микробиоту кишечника с патогенезом многочисленных заболеваний, включая артериальную гипертонию (АГ) и ишемическую болезнь сердца [3]. Среди метаболитов кишечной микрофлоры особое внимание привлекает триметиламин N-оксид (ТМАО), обладающий прямым аритмогенным эффектом [4]. ТМАО, являясь фактором низкоинтенсивного воспаления, реализует свое участие посредством активации фибробластов, что приводит к развитию кардиофиброза и нарушению электрической гомогенности миокарда [4][5].

Эпидемиологические исследования китайских ученых свидетельствуют о дозозависимом влиянии ТМАО на вероятность развития фибрилляции предсердий (ФП): повышение концентрации циркулирующего ТМАО на 1, 5 и 10 мкмоль/л сопровождается увеличением риска развития ФП на 6%, 32% и 73%, соответственно [6]. Высокие значения ТМАО в плазме крови ассоциированы с увеличением общей и сердечно-сосудистой смертности на 65% и 86%, соответственно. У пациентов с ФП и высокими концентрациями ТМАО риск ишемического инсульта возрастает на 89% [7]. Кроме того, повышенный уровень ТМАО коррелирует с увеличением частоты рецидивов ФП после проведения аблации, снижая эффективность существующих методов лечения [8].

Необходимо отметить, что состав кишечной микробиоты является не единственным фактором, определяющим концентрацию микробных метаболитов и выраженность низкоинтенсивного воспаления [2]. Оценка функционального состояния кишечного барьера представляется неотъемлемым компонентом в анализе взаимодействия между макро- и микроорганизмами. Повышенная концентрация зонулина в фекалиях коррелирует с развитием множества патологических состояний, связанных с дисбиотическими изменениями кишечной микрофлоры [9].

Выявление лабораторного биомаркера, позволяющего прогнозировать риск осложнений ФП, представляет значительную ценность для современной медицины. Однако имеющиеся научные данные противоречивы и не позволяют сформулировать однозначные заключения о наличии четкой связи между различными клинико-соматическими характеристиками ФП и концентрациями зонулина и ТМАО [10][11].

Целью исследования является сравнительный анализ профилей зонулина в кале и ТМАО в плазме крови у здоровых добровольцев и пациентов с ФП, а также определение влияния различных клинико-нозологических вариантов аритмии на уровни исследуемых лабораторных показателей.

Материал и методы

В сравнительном исследовании приняло участие 163 человека, представленных двумя группами.

В первую сравнительную группу включены здоровые участники профилактического осмотра (48 человек). У всех здоровых пациентов отсутствовали установленные хронические неинфекционные заболевания.

Во вторую группу вошли пациенты с установленным диагнозом ФП (113 человек). В исследование включали пациентов 18-65 лет с подписанным информированным согласием и зарегистрированным эпизодом ФП длительностью ≥30 сек на электрокардиограмме. Исключали при беременности/лактации, онкологии, впервые диагностированной ФП, сахарном диабете, хронических неинфекционных клинически значимых (требующих лечения) заболеваниях (за исключением АГ и хронической сердечной недостаточности (ХСН)), острых умеренных/тяжелых состояниях (с лихорадкой или без), инфекции вызванной вирусами гепатита B и C, а также вирусом иммунодефицита человека, резекции кишечника, приеме в последние 3 мес. в любой форме антибиотиков, противогрибковых, противовирусных, антипаразитарных препаратов, кортикостероидов, цитокинов, иммуносупрессоров, коммерческих пробиотиков, живых вакцин, сосудистой катастрофе менее 6 мес. назад, протезированном митральном клапане, приверженности терапии <50%, злоупотреблении алкоголем (AUDIT ≥15 баллов). На момент включения в исследование пациенты получали антиаритмическую и/или антикоагулянтную терапию.

Все участники исследования не принимали антибактериальные препараты в течение минимум последних 24 мес.

Для оценки воспалительного индекса питания (DII) использовали адаптированный для стран СНГ опросник Food Frequency Questionnaire [12]. Проницаемость кишечной стенки оценивали посредством исследования уровня зонулина в кале (тест-система ELISA IDK Zonulin (Stool), Германия). В качестве маркера метаболической активности микробиоты использовался уровень ТМАО плазмы крови (тест-система ELISA Kit for Trimethylamine Oxide, cloud-clone, Китай).

Для оценки качества жизни применяли опросник Short Form-36 (SF-36). Оценка проводилась по 8 шкалам: Physical Functioning (PF), Role-Physical (RP), Bodily Pain (BP), General Health (GH), Vitality (VT), Social Functioning (SF), Role-Emotional (RE), Mental Health (MH); и двум интегральным ортогональным показателям: Physical Component Summary (PCS) и Mental Component Summary (MCS).

В качестве меры центральной тенденции при описании данных использовались медиана и квартили (Me, Q1-Q3).

Статистическая обработка данных выполнялась с использованием языка программирования Python и специализированных библиотек для работы с данными (NumPy, Pandas, SciPy, scikit-learn). Для частотного сравнения выборок по категориальным признакам использовался Pearson`s Chi-squared (Chi-squared). В качестве критерия для парных сравнений применялся Kolmogorov-Smirnov (KS). Для исключения ошибки множественных сравнений статистический анализ проводился с использованием критерия Kruskal-Wallis (Kru) и Dunn методом Benjamini-Hochberg. Для выявления монотонной связи между признаками — коэффициент корреляции Spearman`s. В качестве градации силы связи определены следующие диапазоны: <|0,3| (очень слабая), <|0,5| (слабая), <|0,7| (умеренная), <|0,9| (сильная), ≥|0,9| (очень сильная). Оценку влияния ФП и ее клинических вариантов на уровни зонулина и ТМАО относительно здоровых участников исследования осуществляли по модели линейной регрессии методом наименьших квадратов (OLS). Для оценки уровня дисперсии, описываемого OLS, использован коэффициент детерминации (R²). В качестве уровня альфа было определено значение 0,05.

Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ОмГМУ (№ 11 от 16.09.2022).

По возрастным характеристикам группы статистически не различались (KS p>0,05; от 37 до 60 лет, Mе =46, 41,8-53,3; и от 40 до 59 лет, Mе =49, 43-53, соответственно). Доля мужчин в группе ФП была большей, чем в группе здоровых (Chi-squared p<0,05), 81% женщин и 19% мужчин в группе здоровых и 49,6% и 50,4% в группе пациентов с ФП, соответственно.

Результаты

В исследовании учитывали факторы, которые потенциально могут оказывать воздействие на качественные и количественные характеристики микробиоты кишечника (табл. 1).

Аналогичное сравнение было проведено в отношении категориальных признаков (курение, тип активности, тяжесть перенесенной коронавирусной инфекции, вакцинация от коронавирусной инфекции, тип места проживания, тип уборной и душа, частота приема душа в неделю, контакт с животными). Статистически значимо различались количество потребляемого алкоголя, тип недельной физической активности и вакцинация от коронавирусной инфекции (Chi-squared p value<0,05).

Уровень ТМАО у здоровых лиц составил 2,1-5,6 мкмоль/л (Me =2,7; 2,4-3,2), тогда как у пациентов с ФП — 2,4-11,5 мкмоль/л (Me =5,2; 4,4-6,4); распределения статистически значимо различались (KS p<0,05).

Уровень зонулина у здоровых участников находился в диапазоне 32,5-77,8 нг/мл (Me =50,4; 46,6-67,6), тогда как у пациентов с ФП — 86,2-178,5 нг/мл (Me =111,5; 101,8-124); распределения также значимо различались (KS p<0,05).

Показатели диетического воспалительного индекса (DII) между группами однородны (KS p≥0,05): у здоровых 1,4-6,4 (Me =3,8; 2,1-4,75), у пациентов с ФП 1,8-6,8 (Me =3,6; 2,1-4,9).

Для выявления монотонной связи между признаками выборки были объединены. При проведении корреляционного анализа (Spearman`s) не выявлено ни одной связи очень высокой силы (табл. 2). При этом сильная положительная связь определялась между уровнем зонулина в кале и результатами опросника Gastrointestinal Symptom Rating Scale (GSRS) по всем шкалам и ТМАО по доменам констипации, абдоминальной боли и рефлюкса. Сильная отрицательная связь выявлена между лабораторными показателями и рядом шкал опросника SF-36 (ТМАО: PF, RP, GH, PCS; Зонулин: GH, PCS).

Категориальные признаки с упорядоченной структурой (длительность ФП, недельное потребление алкоголя и т.д.) были преобразованы в ранговые переменные для оценки их монотонной связи с исследуемыми показателями и результатами опросника SF-36.

Такие клинические характеристики, как тип и продолжительность ФП, результаты по шкале European Heart Rhythm Association (EHRA), наличие, продолжительность и тип АГ формировали с лабораторными показателями сильную и очень сильную положительные связи, а наличие ХСН — умеренную. Остальные признаки связаны с зонулином и ТМАО незначительно (табл. 3).

Между результатами опросника SF-36 и клиническими характеристиками определялись преимущественно сильная и умеренная отрицательные связи. В большей степени с клинико-нозологическими характеристиками ФП связаны показатели GH, PF, RP и SF, а также интегральный PCS.

На основании выявленной монотонной связи с ранговыми признаками было выполнено межгрупповое и множественное парное сравнение уровней ТМАО и зонулина в разрезе ранговых клинических признаков.

Во всех рассматриваемых подвыборках выявлены статистически значимые различия в распределении уровня ТМАО (Kru p<0,05). При множественном парном сравнении по типу ФП, наличию АГ и наличию ХСН выявлены значимые различия между всеми парами (Dunn p<0,05). Пациенты, страдающие ФП >5 лет по уровню ТМАО не отличались от подвыборки страдающих ФП от 1 до 5 лет (Dunn p>0,05). Не выявлено различий между классами EHRA III и IIB, а также между пациентами с ФП и контролируемой и неконтролируемой АГ (Dunn p>0,05). Участники исследования, страдающие АГ менее года, статистически не отличались по уровню ТМАО от лиц без выявленной АГ, так же как и подвыборки пациентов с АГ >5 лет, и от 1 до 5 лет (Dunn p>0,05). Аналогичные результаты получены при парном сравнении подвыборок по признаку продолжительности ХСН.

Аналогично сравнению подвыборок по распределению ТМАО, во всех рассматриваемых подвыборках выявлены статистически значимые различия в распределении уровня зонулина (Kru p<0,05). При множественном парном сравнении по типу ФП, наличию АГ, наличию ХСН выявлены значимые различия между всеми парами (Dunn p<0,05). Пациенты, страдающие ФП >5 лет по уровню зонулина не отличались от подвыборки, страдающей ФП от 1 до 5 лет (Dunn p>0,05). Больные ФП с оценкой по модифицированной шкале EHRA III значимо не отличались по распределению уровня зонулина от пациентов, соответствующих IIB, так же и пациенты I и IIA групп (Dunn p>0,05). Пациенты с ФП и контролируемой формой АГ по уровню ТМАО крови статистически значимо не отличались от подвыборки с неконтролируемой гипертензией и ФП. Участники исследования с ФП и АГ не отличались друг от друга по распределению уровня зонулина в разрезе продолжительности АГ (Dunn p>0,05). Аналогичная картина была с распределением зонулина по продолжительности ХСН, при этом группа пациентов, страдающих ХСН <1 года, не отличалась от таковой без ХСН (Dunn p>0,05).

На основании полученных данных были отобраны клинические признаки для регрессионного анализа: тип ФП, EHRA, наличие АГ и наличие ХСН.

Построенная модель линейной регрессии объясняет 80% вариабельности уровня ТМАО (R²=0,80). Референсной категорией являлись здоровые участники (интерсепт 2,9 мкмоль/л). Наличие ФП ассоциировано с повышением уровня ТМАО на 1,1 мкмоль/л. Для персистирующего и длительно персистирующего типов ФП коэффициенты составили 0,42 и 1,79 мкмоль/л, соответственно. В зависимости от выраженности симптомов по модифицированной шкале EHRA коэффициенты составили -0,47 для класса I и 1,78 для класса III. АГ и ХСН у пациентов с ФП увеличивали уровень ТМАО на 0,86 и 0,80 мкмоль/л, соответственно. Пароксизмальный тип ФП, а также классы EHRA IIA и IIB не оказывали независимого влияния на уровень ТМАО (0 ∈ 97,5% доверительный интервал).

Аналогичная модель для уровня зонулина в кале также объясняла 80% вариабельности показателя (R²=0,80). Базовый уровень зонулина у здоровых участников составил 54,8 нг/мл. Наличие ФП ассоциировалось с увеличением уровня зонулина на 35,9 нг/мл. Коэффициенты для пароксизмального, персистирующего и длительно персистирующего типов ФП составили 6,4, 11,2 и 22,8 нг/мл, соответственно. Для функциональных классов EHRA IIB и III коэффициенты составили 7,7 и 30,2 нг/мл. Сопутствующие АГ и ХСН увеличивали уровень зонулина на 7,7 и 1,2 нг/мл, соответственно. Классы EHRA I и IIA не продемонстрировали самостоятельного влияния на уровень зонулина (0 ∈ 97,5% доверительный интервал).

Обсуждение

Группы были сопоставимы по основным социально-демографическим и клиническим характеристикам; выявленные различия касались лишь средненедельного употребления алкоголя (Chi-squared p<0,05). При этом ни один участник не употреблял >3 алкогольных единиц в неделю, а по шкале AUDIT злоупотребление алкоголем отсутствовало, что минимизирует его влияние на результаты.

Здоровые участники имели достоверно более высокие показатели качества жизни по сравнению с больными ФП, при этом клинико-нозологические варианты ФП отрицательно коррелировали с большинством шкал.

Уровень DII не различался между группами и не был связан с клиническими характеристиками, что указывает на сходный воспалительный профиль рациона питания у здоровых лиц и пациентов с ФП. В то же время для больных ФП оказались характерны значимо более высокие уровни ТМАО плазмы крови и зонулина в кале по сравнению со здоровыми участниками. Стандартизированного протокола для рутинного исследования ТМАО в клинической практике на сегодняшний день не существует. В качестве материала для исследования используется плазма или сыворотка крови, а в качестве методов исследования лаборатории применяют иммуноферментный анализ, жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией и высокоэффективную жидкостную хроматографию с тандемной масс-спектрометрией. Для научного сообщества вопрос исследования ТМАО у больных ФП остается новым и малоизученным. Исследований не так много и наибольший вклад в изучение по данному вектору вносят коллеги из Азии. Имеющиеся данные в отношении уровня ТМАО, характерного для пациентов с ФП, разнородны, однако полученные результаты согласуются с имеющейся информацией об уровне метаболита у больных ФП (Ме =5,6, 3,4-10,5 мкмоль/л) [13]. Данных об исследовании зонулина в кале у больных ФП в научной литературе нет.

Различия распределений ТМАО и зонулина между группами обусловлены их монотонной связью с клинико-нозологическими вариантами ФП. Однако пароксизмальный тип ФП и классы EHRA IIA-IIB не оказывали самостоятельного значимого влияния на уровень ТМАО, а классы EHRA I-IIA — на уровень зонулина. В научной литературе пока не описано влияние перекрестного сочетания клинико-нозологических характеристик течения ФП, сходного с текущим исследованием. Имеются данные о том, что длительность течения ФП, тип ФП и факт наличия ХСН изолированно положительно коррелируют с уровнем ТМАО плазмы крови [14].

Согласно предиктивным моделям, у пациента с пароксизмальной ФП, EHRA I, без АГ и ХСН ожидаемые уровни ТМАО и зонулина составляли 3,6 мкмоль/л и 97 нг/мл, соответственно, тогда как при длительно персистирующей ФП, EHRA III, наличии АГ и ХСН — 9,3 мкмоль/л и 153 нг/мл. Минимальный эффект ФП относительно здоровых лиц составил +27,6% для ТМАО и +77% для зонулина (0,8 мкмоль/л и 42,2 нг/мл), максимальный — +220,7% и +180,1% (6,4 мкмоль/л и 98,8 нг/мл), что указывает на выраженную зависимость уровней этих маркеров от клинико-нозологических вариантов ФП.

Ограничения исследования. Относительно небольшой объем выборки, ограничивающий статистическую мощность и экстраполяцию полученных результатов на популяционный уровень. Одномоментный дизайн не позволяет установить причинно-следственные связи. Отсутствует поправка на сопутствующую антиаритмическую, антикоагулянтную терапию. В исследование включались пациенты с ожирением. Результаты не прошли внешнюю валидацию в независимых когортах, поэтому их применимость за пределами данной выборки требует дальнейшего подтверждения в многоцентровых исследованиях. С учетом указанных ограничений полученные результаты следует рассматривать как предварительные. Для подтверждения выявленных закономерностей необходимы дальнейшие проспективные исследования с большим объемом выборки.

Заключение

Пациенты с ФП оказались ассоциированы со значимо более высокими уровнями зонулина в кале и ТМАО в плазме крови, а также с более низкими результатам по опроснику SF-36, относительно здоровых лиц.

Для здоровых участников исследования и лиц с ФП характерен провоспалительный профиль пищевого рациона, статистически не различающийся по величине DII.

Содержание зонулина в кале, ТМАО плазмы и результаты опросника SF-36 коррелируют с клинико-нозологическими вариантами ФП, включающими в себя: тип ФП, оценку выраженности симптомов по модифицированной шкале EHRA и наличие или отсутствие АГ и ХСН.

Указанное свидетельствует, что зонулин в кале и ТМАО плазмы крови у больных ФП могут рассматриваться в качестве потенциальных маркеров, ассоциированных с клинико-нозологическими характеристиками ФП, что требует дальнейшего проспективного изучения.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.