Влияние курения на церамидный профиль жировой ткани пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Предполагается, что это может быть обусловлено недостаточной реализацией стратегий профилактики и плохим контролем факторов риска (ФР) атеросклеротических ССЗ. В настоящее время с целью первичной и вторичной профилактики ССЗ ведется активный поиск новых биомаркеров во взаимосвязи с традиционными ФР. Среди основных кардиоваскулярных ФР особое внимание уделяется курению, которое увеличивает смертность от всех причин и играет решающую роль в развитии атеросклеротических ССЗ [1].

Показано, что курящие пациенты с ишемической болезнью сердца (ИБС) подвергаются коронарной реваскуляризации в более молодом возрасте и имеют высокую смертность по сравнению с некурящими. Кроме того, отказ от курения значительно снижает артериальное давление (АД) и частоту сердечных сокращений уже через 24 ч, а в течение года риск повторных сердечно-сосудистых событий и смертности от всех причин уменьшается вдвое. Более того, отказ от курения в раннем возрасте (40 лет) приводит к снижению риска смертности на 90% [2].

Механизмы отрицательного влияния курения на сердечно-сосудистую систему активно изучаются. Курение вызывает окислительные процессы, отрицательно влияет на функцию тромбоцитов, фибринолиз, воспаление и вазомоторную функцию; все эти проатеросклеротические эффекты удваивают 10-летний риск фатальных исходов у курильщиков по сравнению с некурящими [2]. Кроме того, курение модифицирует липидный обмен, что ускоряет развитие атеросклероза [3]. Особый интерес вызывает влияние курения на церамиды (Cer), которые способны модулировать сигнальные пути, участвующие в регуляции метаболизма глюкозы, синтеза триацилглицеридов, в развитии апоптоза, фиброза и атеросклероза. Повышенные плазменные уровни Cer ассоциированы с атеросклеротическими и сопутствующими заболеваниями, включая ожирение, резистентность к инсулину и сахарный диабет [4]. Но до сих пор не определено, происходит ли модуляция Cer в ответ на типовые патологические процессы, такие как оксидативный стресс, эндотелиальная дисфункция, гипоксия, воспаление, или же Cer активно участвуют в развитии заболеваний, вызывая дисфункциональные изменения в органах и тканях [5][6].

Несмотря на хорошо известную взаимосвязь курения с ССЗ, а также ССЗ и липидами, влияние курения на Cer изучено недостаточно, в основном в экспериментальных исследованиях [7]. Уникальной особенностью Cer является их дифференцированное распределение и накопление в тканях, в отличие от других липидов. Однако данные о содержании Cer в жировой ткани (ЖТ) сердца и сосудов, расположенных в непосредственной близости от очага поражения, и их взаимосвязи с курением практически отсутствуют [8]. В то время как модуляция уровней Cer и их потенциальное использование в качестве биомаркеров имеет важное значение для диагностики и персонализированной терапии при ССЗ.

Цель: изучить особенности церамидного профиля подкожной, эпикардиальной, периваскулярной ЖТ (ПЖТ, ЭЖТ, ПВЖТ, соответственно) у пациентов с ССЗ в зависимости от курения.

Материал и методы

Спектр Cer локальных жировых депо определен у 60 пациентов с ССЗ (30 с ИБС и 30 с приобретенными пороками сердца (ППС)), имеющих показания для проведения прямой реваскуляризации миокарда методом коронарного шунтирования или операции на клапанах сердца (стеноз/недостаточность аортального и митрального клапанов). Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом организации. Обследованные пациенты подписали добровольное информированное согласие и соответствовали критериям включения и исключения, согласно ГОСТ Р 52379-2005 ("Надлежащая клиническая практика") и принципам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (Этические принципы медицинских исследований с участием человека) с учетом изменений, принятых в 2013г, а также "Правилам клинической практики в Российской Федерации", утвержденным Приказом Минздрава России № 266 от 19.06.2003. Критериями исключения были: отказ от проведения исследования, возраст пациентов старше 75 лет, наличие клинически значимой сопутствующей патологии.

Во время оперативного вмешательства на сердце были получены образцы ПЖТ (подкожная клетчатка нижнего угла средостенной раны), ЭЖТ (правые отделы сердца — правое предсердие и правый желудочек) и ПВЖТ (область правой коронарной артерии) массой 3-5 г, которые подвергались криогенной заморозке жидким азотом и хранению при температуре -150° С.

Приготовление образцов локальных жировых депо пациентов. Образцы ЖТ соответствующей массы гомогенизировали, вносили 700 мкл смеси, состоящей из хлороформа и метанола в соотношении 2:1 по объёму, помещали в ультразвуковую ванну на 10 мин. После чего вливали очищенную воду (440 мкл), перемешивали 5 мин на Multi-vortex V-32, центрифугировали 10 мин при 16000 об./мин. К 200 мкл нижнего органического слоя добавляли 500 мкл смеси хлороформ-метанол, перемешивали 5 мин на Multi-vortex V-32, центрифугировали 10 мин при 16000 об./мин. 400 мкл нижнего органического слоя подвергали упариванию досуха в токе азота при комнатной температуре 15 мин при помощи концентратора Organomation MULTIVAP. Полученный сухой остаток растворяли в 1000 мкл смеси изопропилового спирта и ацетонитрила 1:1 по объёму, перемешивали 5 мин на Multi-vortex V-32, центрифугировали 10 мин при 16000 об./мин. Для приготовления образца контроля качества в виалу со вставкой переносили 200 мкл супернатанта и пулировали 10 мкл каждого образца. Результаты были нормированы на степень разбавления образцов и массу навески.

Определение церамидного профиля в образцах локальных жировых депо пациентов. Для определения церамидного профиля в образцах ЖТ пациентов использовали систему высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием ионов-прекурсоров фрагмента с m/z 264 в диапазоне отношения масса/заряд от 500 до 700 (ВЭЖХ-МС). Предварительно проводили жидкостно-жидкостную экстракцию с помощью хлороформа, метанола и воды. Система ВЭЖХ-МС/МС состояла из тандемного тройного квадрупольного масс-спектрометрического детектора Sciex QTRAP 5500 (ab Sciex, CША) и жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, США). Применяли колонку ZORBAX Eclipse XDB-C18, 2,1×100 мм, 1,8 мкм (Agilent Technologies, США) с предколонкой Security Guard (Phenomenex, США). Данные обрабатывали в программе MultiQuant. Оценка церамидного профиля проведена на базе ЦКП "Клиническая масс-спектрометрия" ФГБУ "НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова" Минздрава России.

Статистический анализ. Статистическая обработка полученных результатов была проведена c использованием пакета прикладных программ "STATISTICA 12" и "GraphPad Prism 8" (GraphPad Software). Результаты представлены в виде медианы, 25-го и 75-го процентилей. Определение межгрупповых различий проводили при помощи непараметрических критериев. Для сравнения 3 независимых групп использовали критерий Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением при помощи U-критерия Манна-Уитни. Для сравнения 2 независимых групп применяли U-критерий Манна-Уитни. Категориальные переменные, выраженные в %, сравнивали при помощи критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при p<0,05 на всех этапах статистического анализ.

Результаты

Анализ клинико-анамнестической характеристики пациентов с ССЗ показал, что пациенты обследованных групп были сопоставимы по возрасту и полу. Анализируемые группы преимущественно состояли из мужчин (табл. 1). Средний возраст пациентов с ИБС составил 65,5 (48,6;69,7) лет, в группе с ППС — 60,4 (44,5;65,6) лет. Пациенты обеих групп имели избыточную массу тела, о чем свидетельствуют значения индекса массы тела в пределах от 25 до 29,9. В анамнезе были зарегистрированы такие модифицируемые ФР, как курение, определяемое как курение по крайней мере 1 сигареты в день в прошлом году; артериальная гипертензия (систолическое АД >140 мм рт.ст., диастолическое АД >90 мм рт.ст.); дислипидемия, установленная на основании ранее зафиксированного в течение как минимум 1 года повышения общего холестерина (ОХС) в сыворотке крови >200 мг/дл, триацилглицериды >200 мг/дл или холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛНП) >150 мг/дл или применения гиполипидемических средств. Так, лица с атеросклеротическим поражением коронарных артерий в среднем 2 раза чаще курили и страдали артериальной гипертензией по сравнению с пациентами с пороками сердца. Нарушения липидного обмена в группе ИБС встречались в 3 раза чаще и характеризовались более высоким содержанием ОХС, ХС-ЛНП и индекса атерогенности в сравнении с группой ППС, при этом уровень холестерина липопротеинов высокой плотности напротив был в 1,4 раза ниже (табл. 1). Инфаркт миокарда, острые нарушения мозгового кровообращения в анамнезе и мультифокальный атеросклероз встречались только в группе с коронарогенной патологией. Пациенты данной группы страдали стенокардией II и III функционального класса (ФК), хронической сердечной недостаточностью, преимущественно I ФК, в то время как пациенты с ППС в большей степени страдали хронической сердечной недостаточностью II ФК. Систолическая функция левого желудочка была оценена по фракции выброса (ФВ) левого желудочка по Тейхольцу. В группе ИБС ФВ соответствовала сохраненной и составила 53,5 (46,2;58,7)%, среди лиц с ППС ФВ была несколько снижена — 51,1 (42,3;55,3)%.

На госпитальном этапе все пациенты получали стандартную медикаментозную терапию согласно рекомендациям Минздрава России (2020) и Европейского общества кардиологов (2020) (табл. 1).

При изучении церамидного спектра ПЖТ, ЭЖТ и ПВЖТ пациентов с ССЗ выявлены следующие виды Cer: насыщенные Cer d18:1/14:0, Cer d18:1/16:0, Cer d18:1/18:0, Cer d18:1/20:0, Cer d18:1/22:0, Cer d18:1/23:0, Cer d18:1/24:0, Cer d18:1/26:0, ненасыщенный Cer d18:1/24:1 и полиненасыщенные Cer d18:1/22:2, Cer d18:1/22:4, Cer d18:1/22:5. Основанием обнаруженных Cer был C18-сфингозин (d18:1), что совпадает с данными литературы [9].

При оценке концентрации Cer в ЖТ пациентов с ССЗ в зависимости от курения получено, что в ЭЖТ некурящих лиц уровни Cer d18:1/14:0, 17:2 были выше, чем в ПЖТ (в 1,4 раза, р=0,0013 и в 2,3 раза, р=0,02, соответственно). Содержание Cer d18:1/18:0 в ЭЖТ и ПВЖТ было двукратно увеличено по сравнению с ПЖТ (р=0,004 и р=0,001, соответственно).

В ПВЖТ наблюдалось повышение Cer d18:1/16:0 и 24:1 относительно ПЖТ (в 1,5 раза, р=0,0018 и 1,3 раза, р=0,0005), 26:0 относительно ЭЖТ (в 1,9 раза, р=0,006). ЭЖТ курящих пациентов характеризовалась увеличенной концентрацией Cer d18:1/14:0 по сравнению с ПЖТ (в 1,4 раза, р=0,012). В ЭЖТ и ПВЖТ уровни Cer d18:1/17:2, 18:0, 20:0, 24:1 были выше, чем в ПЖТ (в 3,1 раза, р=0,015 и 3,8, р=0,011; в 3 раза, р=0,0031 и 3,7 раза, р=0,002; в 3,0 раза, р=0,007 и 2,6 раза, р=0,0011; в 1,4 раза, р=0,031 и в 1,7 раза, р=0,023, соответственно). В ПВЖТ отмечалось повышенное содержание Cer d18:1/16:0, 22:2, 22:5, 23:0, 24:0 относительно ПЖТ (в 2,1 раза, р=0,035; в 1,7 раза, р=0,017; в 1,7 раза, р=0,021; в 1,7 раза, р=0,033; в 1,6 раза, р=0,002, соответственно) и 26:0 относительно ЭЖТ (в 2 раза, р=0,005) (табл. 2).

Были выявлены следующие межгрупповые различия: в ПЖТ курящих пациентов наблюдалось более высокое содержание Cer d18:1/14:0 и 17:0 (в 1,2 раза, р=0,000015 и р=0,0011) и снижение 22:2 и 23:0 (в 1,5 раза, р=0,03 и в 1,6 раза, р=0,004) по сравнению с некурящими, в ЭЖТ курящих лиц — более высокий уровень Cer 22:5 (в 1,4 раза, р=0,00014), в ПВЖТ — 23:0 (в 1,6 раза, р=0,03) относительно некурящих лиц. В ЭЖТ и ПВЖТ курящих пациентов уровни следующих Cer были выше, чем у некурящих: Cer d18:1/16:0 в 1,7 раза (р=0,001) и в 1,6 раза (р=0,003), 17:2 в 1,3 раза (р=0,0001) и 1,9 раза (р=0,006), 18:0 в 1,5 раза (р=0,0002) и в 1,7 раза (р=0,0011), 22:0 в 1,5 раза и 1,4 раза (р=0,006, р=0,003), 24:1 в 1,5 раза и 1,6 раза (р=0,0003, р=0,0011), соответственно (табл. 2).

Обсуждение

В проведенном нами исследовании выявлено специфическое обогащение ЭЖТ курящих пациентов полиненасыщенными Cer d18:1/22:5, ПВЖТ — насыщенными Cer d18:1/23:0 относительно некурящих лиц. В ЭЖТ и ПВЖТ курящих пациентов уровни Cer d18:1/16:0, 17:2, 18:0, 22:0, 24:1 были выше, чем у некурящих лиц. ПЖТ курящих пациентов характеризовалась высоким содержанием Cer d18:1/14:0 и 17:0 и снижением 22:2 и 23:0 по сравнению с некурящими.

Большинство исследований влияния курения на уровни Cer выполнены в плазме/сыворотке крови. В то время как данные о содержании Cer в ЖТ сердца и сосудов и их взаимосвязи с курением у людей практически отсутствуют. Ранее проведенные экспериментальные работы показали накопление Cer, цереброзидов, фосфолипидов и различных сфингоидных оснований — метаболитов пути синтеза Cer de novo в плазме мышей ApoE-/- (хорошо зарекомендовавшей себя мышиной модели атерогенеза человека), подвергшихся воздействию сигаретного дыма [10].

Аналогичные результаты о повышении плазменных уровней Cer продемонстрировали и другие исследователи. Cruickshank-Quinn CI, et al. (2014) определяли, вызывает ли сигаретный дым изменения метаболического профиля липидов у мышей, а также их постоянство после прекращения курения. Показано увеличение Cer d18:1/20:0 и галабиозилцерамидов d18:1/25:0 при применении сигаретного дыма. После прекращения влияния сигаретного дыма их уровни снижались, но были повышены по сравнению с группой контроля, которые подвергались воздействию воздуха [11]. Воздействие сигаретного дыма в течение 3 мес. приводило к значительному повышению отношения Cer d18:1/24:0 и Cer d18:1/24:1 к Cer d18:1/18:0 в плазме, печени, легких и брюшной аорте мышей [12].

Boué S, et al. (2012) показали накопление Cer в стенке аорты мышей ApoE-/-, но накопление эфиров ХС пропорционально превышало накопление Cer. Поскольку было показано значительное увеличение относительной доли дигидро-церамидов и дигидро-сфингомиелинов в аорте мышей, подвергшихся воздействию сигаретного дыма, предполагают, что курение индуцирует синтез Cer de novo в стенке сосудов [10].

Считается, что длинноцепочечные Cer (С14-22) оказывают неблагоприятное влияние на сердечно-сосудистую систему, в то время как очень длинноцепочечные Cer (С23:0-С26:0), напротив, обладают кардиопротективным действием [13][14]. Одним из объяснений такого мнения служит предположение о способности Cer C16:0 хорошо смешиваться с холестерином, влиять на функциональность липидных рафтов и активировать как внутренние, так и внешние пути апоптоза. Cer C24:0 не смешивается должным образом с холестерином, что может объяснить его протективный эффект [15].

Обращает на себя внимание увеличение уровня Cer с двойными связями в ЖТ у курящих пациентов, что может сделать их более восприимчивыми к окислительному стрессу [16]. Действительно, показано, что Cer с двойной связью (ненасыщенные) ведут себя иначе, чем насыщенные: Cer 24:0 обладает защитными эффектами в отношении сердечно-сосудистых событий в отличие от Cer 24:1. Показано, что большинство жирных кислот, подвергающихся β-окислению в сердце, представляют собой мононенасыщенные жирные кислоты [17]. Возможным объяснением считается дисрегуляция метаболизма Cer при ССЗ [18].

Ограничения исследования. 1. Проведенное исследование одноцентровое. 2. Размер выборки невелик. 3. Отсутствие условно здоровых лиц в качестве группы сравнения. 4. Необходимо сопоставление результатов сфинголипидомного профилирования и результатов экспрессии генов ферментов, метаболизирующих сфинголипиды в жировых депо сердца и коронарных сосудов, у пациентов с ССЗ, что даст более полную картину о влиянии курения на метаболизм сфинголипидов, Cer в частности, и является целью будущей работы.

Заключение

Таким образом, локальные жировые депо пациентов с ССЗ отличались по уровню Cer в зависимости от курения. Полученные результаты свидетельствуют о модуляции синтеза Cer и их накоплении преимущественно в ЖТ эпикардиальной и периваскулярной локализации у курящих пациентов. Наблюдаемые изменения могут быть обусловлены рядом причин: избыток жирных кислот, гипоксия, воспаление, активация Toll-like рецепторов (TLR) 4 типа на адипоцитах. Принимая во внимание широкий спектр метаболических эффектов, использование Cer в качестве биомаркеров и мишеней персонализированной терапии является перспективным для выявления лиц высокого риска и улучшения лечебно-диагностических стратегий при ССЗ, имеет огромные перспективы для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых патологий.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-15-20007 "Церамидный профиль локальных жировых депо сердца: клинико-патогенетическое значение и терапевтический потенциал" (https://rscf.ru/project/22-15-20007) и средств Министерства науки и высшего образования Кузбасса.