Редкие варианты гена филамина С среди пациентов с гипертрофической кардиомиопатией, направленных на септальную миоэктомию

Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) является самым распространенным генетически обусловленным заболеванием сердца и характеризуется гипертрофией миокарда, неадекватной гемодинамической нагрузке [1][2]. Она ассоциирована с неблагоприятными исходами — фибрилляцией предсердий, сердечной недостаточностью (СН) и внезапной сердечной смертью [1][2]. В последние годы появляются новые данные, расширяющие представление об этиологии ГКМП, выводя ее за пределы "болезни саркомера": наряду с подтверждением полигенного вклада несаркомерных генов в развитие ГКМП, в спектре моногенных причин также появляются новые несаркомерные гены-кандидаты [3-5].

Примером является ген филамина С (FLNC), экспрессируемый в поперечно-полосатой мускулатуре [6][7]. В кардиомиоцитах FLNC локализован в области Z-диска, где он, соединяясь с тонкими филаментами, обеспечивает механическую стабильность саркомера [6][7]. Расположение в Z-диске и его взаимодействие с другими протеинами данной зоны позволяет ему выполнять функцию узла, обеспечивающего механосенсинг и трансдукцию сигнала [6]. FLNC — динамичный протеин, преобладающая локализация которого может меняться на различных этапах онтогенеза, а также в условиях стресса [6]. В субсарколемме FLNC является частью аппарата костамера, поддерживающего тонкие взаимодействия между саркомером и внеклеточным матриксом [6]. Также FLNC представлен в области вставочных дисков, где его количество повышается в условиях механического стресса [6].

Первые сообщения о выявлении патогенных вариантов FLNC относились к миопатиям, симптомы которых также могли включать гипертрофию левого желудочка [3, 8]. К настоящему моменту большинство сообщений о выявлении вариантов гена FLNC при заболеваниях относятся именно к кардиомиопатиям [3]. Укорачивающие варианты FLNC приводят к развитию дилатационной (ДКМП) и аритмогенной кардиомиопатии правого желудочка по механизму гаплонедостаточности, в то время как миссенс-варианты выявляются при ГКМП и рестриктивной кардиомиопатии (РКМП) и, как предполагается, формируют фенотип заболевания за счет неправильного фолдинга и агрегации протеинов [6][7][9][10]. Согласно исследованию Ader F, et al., варианты FLNC, которые можно идентифицировать как причинные, выявляются в 1,3% случаев ГКМП [10].

На настоящий момент остается актуальным вопрос о патогенности выявляемых у пациентов с ГКМП вариантов в гене FLNC, поскольку подавляющее их большинство являются миссенс и классифицируются как варианты неопределенной клинической значимости [3][7]. Изучение корреляции генотип-фенотип у пациентов с вариантами FLNC и ГКМП с более тяжелым клиническим течением может представлять актуальную научную задачу в рамках интерпретации вариантов FLNC при данной кардиомиопатии.

Наличие обструкции выносящего тракта левого желудочка (ВТЛЖ) является одним из ключевых эхокардиографических признаков, позволяющим идентифицировать подгруппу повышенного риска развития неблагоприятных событий [11][12]. Так, подавляющее большинство случаев СН при ГКМП формируется у пациентов с обструктивной формой, также наличие обструкции ВТЛЖ является фактором, повышающим риск развития внезапной сердечной смерти [11][12]. Пациенты с обструкцией ВТЛЖ имеют более выраженную диастолическую дисфункцию, выявляемую при эхокардиографии (ЭхоКГ), и более распространенный фиброз по данным магнитно-резонансной томографии, который локализован не только фокально в области гипертрофированного миокарда, но и носит диффузный характер, что, как предполагается, обусловлено хронической перегрузкой давлением [13]. Симптомным пациентам, рефрактерным к медикаментозной терапии, с тяжелой обструкцией ВТЛЖ, определяемой по пиковому градиенту в ВТЛЖ ≥50 мм рт.ст., экспертными сообществами рекомендовано проведение процедуры септальной миоэктомии [1][2].

На настоящий момент в литературе отсутствуют данные о спектре вариантов гена FLNC в когорте пациентов с обструктивной ГКМП и клинических характеристиках пациентов из данной генетической группы.

С помощью технологии секвенирования нового поколения, цель исследования — определить частоту и спектр редких вариантов FLNC среди взрослых пациентов с обструктивной ГКМП, направленных на септальную миоэктомию, дать клиническую и патоморфологическую характеристику ГКМП, протекающей на фоне данных вариантов.

Материал и методы

Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено локальным этическим комитетом НМИЦ им. В. А. Алмазова, перед включением у всех участников было получено письменное информированное согласие.

В исследование включено 98 неродственных пациентов с ГКМП, госпитализированных в НМИЦ им. В. А. Алмазова с целью проведения процедуры септальной миоэктомии (рис. 1). Для 58 пациентов было выполнено генетическое исследование методом секвенирования нового поколения с использованием целевой кардиопанели для проверки 39 генов, ассоциированных с развитием кардиомиопатий (список генов в Приложении). Еще 40 пациентам генетическое исследование методом массового параллельного секвенирования было выполнено с применением целевой панели на 17 генов (список генов в Приложении). Секвенирование библиотек было проведено с использованием набора целевого обогащения SureSelect Human All Exon V6 r2 (60Mbp) (Agilent Technologies, США) при помощи секвенатора Illumina HiSeq и SBSv4 реактивов (Illumina, США). Выравнивание, обработка данных и аннотации были выполнены с использованием референса генома человека hg19.

По результатам проведенного генетического тестирования были отобраны пациенты с редкими вариантами FLNC (MAF <0,01%), последние были классифицированы согласно рекомендациям Американской коллегии медицинской генетики (ACMG) [14]. Для отобранных пациентов были проанализированы данные анамнеза, ЭхоКГ, электрокардиограммы, выполненные до миоэктомии, холтеровского мониторирования. Дана патоморфологическая характеристика миокарда межжелудочковой перегородки (МЖП), полученного интраоперационно в ходе процедуры миоэктомии. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-20-00271 П.

Результаты

Генетическая характеристика. Среди 98 проанализированных пациентов выявлено 4 пациента с редкими вариантами FLNC — 2 мужчины и 2 женщины (рис. 1, табл. 1). Данные варианты определены как миссенс и находились в гетерозиготном состоянии: p.Pro1774Ser, p.His1834Tyr и p.Thr1317Pro, при этом вариант p.His1834Tyr был обнаружен дважды, у двух неродственных пациентов (пациенты А-Г, соответственно). Все указанные варианты согласно ACMG/AMP классифицированы как варианты неопределенной клинической значимости. Ни один из указанных вариантов FLNC не был описан ранее в литературе. Вариант FLNC p.Thr1317Pro выявлен в сочетании с патогенным вариантом в гене MYH7 p.Val606Leu (табл. 1). Вариант FLNC p.Thr1317Pro был локализован в домене ROD1, остальные — в ROD2. Анализ предсказания патогенности in silico на основе вычислительных моделей продемонстрировал доказательства в пользу патогенного характера вариантов p.His1834Tyr и p.Thr1317Pro и доброкачественного характера для варианта p.Pro1774Ser (табл. 2).

Клиническая характеристика. У всех четырех пациентов заболевание дебютировало после 40 лет — в 41, 43, 45 и 64 года, — что потребовало проведения септальной миоэктомии спустя 1-4 года (табл. 1). Клиническая картина была представлена умеренными проявлениями СН и стенокардии на уровне II функционального класса; у пациента с вариантами FLNC+MYH7 наблюдались также синкопальные состояния. Не было зарегистрировано пароксизмов неустойчивой желудочковой тахикардии и фибрилляции предсердий. По данным проанализированных историй болезней не было указаний на наследственный характер заболевания.

Анализ ЭхоКГ и данных магнитно-резонансной томографии показал, что все пациенты с вариантами FLNC характеризовались промежуточной степенью выраженности гипертрофии левого желудочка без экстремальных значений: максимальная толщина стенок составила от 19 до 29 мм. У пациентки Б с вариантом p.His1834Tyr наблюдалась двояковыпуклая МЖП, что приводило к формированию обструкции на уровне базальных и срединных отделов, в то время как у остальных пациентов преобладал вариант с гипертрофией преимущественно базальных отделов МЖП (рис. 2). Ни один из пациентов на момент исследования не достиг гипокинетической фазы ГКМП, определяемой при фракции выброса по Симпсон <50%. У всех пациентов диастолическая дисфункция соответствовала 1 или 2 степени, дилатация левого предсердия также не превышала умеренных значений (индекс объема левого предсердия от 37 до 45 мл/м²), а показатели расчетного систолического давления в легочной артерии соответствовали легочной гипертензии 1 степени. Клинические характеристики пациентов с редкими вариантами FLNC суммированы в таблице 1.

Во фрагментах миокарда МЖП, полученного интраоперационно, у всех пациентов наблюдались признаки ГКМП, такие как гипертрофия кардиомиоцитов, феномен "disarray" (дискомплексация) различной степени выраженности и мелкоочаговый фиброз (табл. 3). Дискомплексация кардиомиоцитов >15% выявлена у пациента с вариантом FLNC p.Pro1774Ser, а также у пациента с вариантами MYH7+FLNC p.Val606Leu и p.Thr1317Pro, соответственно, тогда как у оставшихся пациентов disarray составил <15%. Кроме того, у всех пациентов наблюдалось утолщение и фиброз эндокарда. Не было выявлено признаков амилоидоза и гликогеноза.

Обсуждение

В данной работе мы сфокусировались на вариантах гена FLNC, претендующего на роль причинного в развитии несаркомерных форм ГКМП. Особенность этого исследования заключается в том, что оно выполнено в когорте пациентов с обструктивной ГКМП, отобранных для проведения процедуры септальной миоэктомии, а значит, представляющих собой подгруппу повышенного риска развития неблагоприятных клинических исходов [11][12].

Изучение генетических основ и патогенетических механизмов формирования несаркомерной ГКМП имеет особый смысл на современном этапе лечения данной патологии: появление терапии обструктивной ГКМП ингибиторами сердечного миозина, основные механизмы работы которого изучены на клетках с мутациями генов саркомера, поднимает вопросы о потенциальной эффективности данной терапии в когорте пациентов без патогенных вариантов в генах саркомера, которая составляет 40-60% всех пациентов с ГКМП [4][5][15][16].

Среди 98 проанализированных пациентов редкие варианты FLNC были выявлены у 4 пациентов, что составляет 4%, согласуется с частотой редких вариантов FLNC в общей популяции пациентов с ГКМП, варьирующей по данным литературы от 1,3 до 5,0% [10][17-19]. Два из трех выявленных вариантов (p.Pro1774Ser и p.His1834Tyr) расположены в домене ROD2, являющемся мутационной горячей точкой [6][7]. Он является важным доменом для внутриклеточного сигналлинга, димеризации филамина и взаимодействия с Z-диском, в связи с чем, как предполагается, миссенс-варианты, локализованные в домене ROD2, имеют высокую вероятность быть патогенными для ГКМП [7]. Замена p.Thr1317Pro обнаружена в домене ROD1, являющемся еще одной распространенной локализацией вариантов для FLNC-ГКМП [6][7]. Ни один из указанных вариантов не был описан ранее в литературе.

Клиническое течение у носителей редких вариантов FLNC в нашем исследовании характеризовалось умеренной тяжестью: дебют заболевания произошел после 40 лет, СН не достигала продвинутых стадий, не было зафиксировано прогностически неблагоприятных желудочковых нарушений ритма и фибрилляции предсердий. Данные ЭхоКГ продемонстрировали легкую или умеренную степень дилатации левого предсердия, диастолическую дисфункцию первой или второй стадии, отсутствие снижения контрактильности и рестриктивного кровотока. Эти результаты также согласуются с данными литературы, где по основным клиническим характеристикам большинство носителей вариантов FLNC не отличались значимо от остальных пациентов с ГКМП [17][18].

К настоящему моменту выявлены определенные закономерности в реализации фенотипа FLNC-кардиомиопатий, в зависимости от функциональных характеристик причинного генетического варианта. Так, известно, что укорачивающие варианты FLNC (truncFLNC) преобладают у пациентов с ДКМП и аритмогенной дисплазии правого желудочка. Такие варианты несут в себе стоп-кодон и, как предполагается, запускают высококонсервативный механизм нонсенс-опосредованного распада РНК, в результате которого мутантный FLNC не синтезируется, количество FLNC в клетке снижается и возникает его гаплонедостаточность [6]. Данный механизм был заподозрен на основании того, что в цитоплазме кардиомиоцитов пациентов с truncFLNC-ДКМП не было выявлено агрегатов FLNC, в животных моделях truncFLNC с применением рыб данио-рерио и крысиных миобластов также не было выявлено агрегатов FLNC [6][9]. На гистологическом уровне у пациентов с truncFLNC-ДКМП наблюдаются участки выраженного циркулярного фиброза, что приводит к электрофизиологической нестабильности и прогностически неблагоприятным желудочковым аритмиям [9]. В связи с чем наличие truncFLNC у пациентов с ДКМП выделено отдельным пунктом в клинических рекомендациях при принятии решения об имплантации кардиовертера-дефибриллятора [1].

В свою очередь, у пациентов с ГКМП truncFLNC варианты никогда не были выявлены [20]. Вместо этого у пациентов с ГКМП и РКМП преобладают неукорачивающие варианты FLNC, из которых ~95% составляют миссенс-варианты [6]. Для миссенс-вариантов FLNC основным предполагаемым механизмом формирования фенотипа кардиомиопатии является неправильный фолдинг и агрегация протеинов, которые склонны локализовываться вокруг ядра [20-22]. С точки зрения клинических проявлений, большинство сообщений о РКМП на фоне миссенс-вариантов FLNC составляют случаи неблагоприятного течения с дебютом в детском возрасте, нередко в сочетании с нейромышечным фенотипом [21-26], в то время как ГКМП на фоне миссенс-вариантов FLNC не отличалась по своим клиническим характеристикам от общей когорты пациентов с ГКМП [17][18], с чем согласуются результаты нашего исследования. Исключения представляют собой единичные описания FLNC-ГКМП с яркой клинической картиной, неблагоприятным прогнозом и высокой семейной агрегацией [20][27].

По настоящий момент однозначная клиническая интерпретация редких вариантов FLNC, выявляемых среди пациентов с ГКМП, затруднена. Во-первых, для большинства выявляемых при ГКМП миссенс-вариантов FLNC отсутствуют функциональные исследования, в связи с чем они сохраняют за собой статус вариантов неопределенной клинической значимости. Во-вторых, имеются данные, ставящее под сомнение само положение о том, что варианты FLNC вызывают ГКМП: так, в работе Cui H, et al. 2018г частота вариантов FLNC в когорте 540 пациентов ГКМП не отличалась статистически значимо от таковой в группе 307 здоровых добровольцев [17], и, таким образом, могла отражать распространенность редких, но доброкачественных вариантов. Мы полагаем, что влияние миссенс-вариантов FLNC на реализацию фенотипа кардиомиопатий может представлять собой спектр: от модифицирующего влияния к вариантам с большего размера генетическим эффектом, что, вероятно, зависит от функциональных последствий конкретного генетического варианта.

Роль гистологических находок в диагностике и ведении ГКМП на современном этапе ее изучения остается неуточненной [28]. Характерными гистопатологическими признаками ГКМП являются гипертрофия и дискомплексация (феномен disarray) кардиомиоцитов, аномалии малых интрамуральных сосудов, интерстициальный и заместительный фиброз [28]. Известно, что феномен disarray более выражен у молодых пациентов с ГКМП, погибших от внезапной сердечной смерти, однако для установления четкой взаимосвязи между степенью дискомплексации и выживаемостью существующих данных недостаточно [28-30]. Заместительный фиброз связывают с ишемией, возникающей на фоне поражения малых сосудов, и он в большей степени, по-видимому, участвует в формировании осложнений при ГКМП, в то время как интерстициальный фиброз способствует диастолической дисфункции и дилатации предсердий [28][30]. В нашем исследовании у пациентов с вариантами FLNC при гистологическом исследовании фрагментов МЖП не было выявлено участков заместительного фиброза, но у всех был описан интерстициальный его вариант, что на клиническом уровне соответствовало умеренной или легкой диастолической дисфункции и отсутствию желудочковых нарушений ритма и, таким образом, согласуется с описанными выше литературными данными [28][30]. У всех пациентов с FLNC-ГКМП было выявлено утолщение эндокарда, характерное для пациентов старшей возрастной группы [30].

Отдельно мы бы хотели обсудить случай пациента Г, у которого было выявлено сочетание несаркомерного варианта FLNC p.Thr1317Pro неопределенной клинической значимости и патогенного варианта в гене саркомера MYH7 p.Val606Leu. Несмотря на то, что выявление патогенного саркомерного варианта само по себе достаточно для объяснения формирования фенотипа ГКМП, нам представляется важным сообщать о подобных клинических случаях в связи с доказанной неполной пенетрантностью саркомерных генетических вариантов и растущими свидетельствами полигенной природы ГКМП [3-5][31][32]. Сочетание вариантов FLNC с саркомерными описано в когорте пациентов с ГКМП: так, в исследовании Cui H, et al. у каждого третьего пациента с вариантом FLNC были также выявлены патогенные и вероятно патогенные варианты в генах саркомера [17]. Мы полагаем, что вариант FLNC p.Thr1317Pro также мог участвовать в формировании фенотипа заболевания, в роли модификатора или как самостоятельный причинный вариант.

К недостаткам нашего исследования следует отнести отсутствие сегрегационного анализа, а также отсутствие функциональных исследований для выявленных вариантов, в связи с чем их клиническая интерпретация затруднена, что требует дальнейшего экспериментального подтверждения и популяционных исследований.

Заключение

В приведенных случаях клинические характеристики носителей редких миссенс-вариантов FLNC среди пациентов с обструктивной ГКМП, направленных на септальную миоэктомию, не отличались от большинства пациентов в общей когорте ГКМП и характеризовались дебютом заболевания после четвертой декады жизни, отсутствием гипокинетических форм, рестриктивного кровотока и жизнеугрожающих желудочковых аритмий. Дальнейшие функциональные и популяционные исследования должны пролить свет на корреляцию генотип-фенотип у пациентов с миссенс-вариантами FLNC и ГКМП.

Отношения и деятельность. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-20-00271 П.