Ассоциации белка промежуточного слоя хряща 1 типа и индуцируемого гипоксией фактора-1-альфа с результатами трансторакальной эхокардиографии у больных с сердечной недостаточностью с сохраненной фракцией выброса

Сердечная недостаточность (СН) остается одной из основных причин смерти от сердечно-сосудистых заболеваний. Значительный вклад в развитие СН вносят такие заболевания, как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, фибрилляция предсердий (ФП), сахарный диабет (СД) 2 типа и ожирение. Несмотря на использование комбинированной терапии, число больных с СН в нашей стране выросло за последние 20 лет [1]. Особое место в структуре СН занимает СН с сохраненной фракцией выброса (СНсФВ), на долю которой приходится >50% всех больных с СН в Российской Федерации. Диагностика СНсФВ представляет собой более трудную задачу, чем СН со сниженной фракцией выброса (ФВ) левого желудочка (ЛЖ), для верификации которой требуется только наличие симптомов или признаков СН со снижением ФВ <50% по данным эхокардиографии (ЭхоКГ). Для верификации СНсФВ до сих пор нет четких критериев диагностики, а существующие алгоритмы направлены, в основном, на оценку вероятности наличия заболевания [2]. Ограниченные возможности терапии СНсФВ и отсутствие единого алгоритма диагностики обусловливают необходимость исследований по поиску новых маркеров для оптимизации диагностики данной нозологии [3, 4].

Анализ возможности использования биохимических маркеров при СНсФВ является актуальной научной задачей на стыке кардиологии, медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики. Применение мозгового натрийуретического пептида при СНсФВ ограничено, т. к. его концентрации при этой патологии достоверно ниже, чем у пациентов с СН с низкой ФВ ЛЖ. Более стабильный предшественник BNP — N-концевой промозговой натрийуретический пептид (NT-proBNP) является более эффективным биохимическим маркером, предсказывающим риск развития осложнений и прогрессирования СНсФВ, но на его концентрацию влияют такие факторы, как ФП, почечная функция и ожирение [5]. Таким образом, целесообразным является подход, при котором исследования натрийуретических пептидов дополняются анализом других биомаркеров − так называемая комбинированная биомаркерная стратегия [6][7].

Помимо поиска непосредственно диагностических маркеров для выявления СНсФВ, важной задачей медицинской биохимии является идентификация биохимических факторов, отражающих тот или иной патофизиологический процесс, сопряженный с данным заболеванием. При СН происходит ремоделирование миокарда, представляющее собой процесс комплексного нарушения его структуры и функции [8], который сопровождается развитием тканевой гипоксии как самого миокарда, так и периферических тканей [9]. Одним из важнейших биохимических факторов, отражающих процессы фиброза и ремоделирования миокарда при СН, можно считать белок промежуточного слоя хряща 1 типа (CILP-1, Cartilage intermediate layer protein 1) [10]. CILP-1 представляет собой белок экстрацеллюлярного матрикса, экспрессирующийся в соединительной ткани и в миокарде, который рассматривается в качестве биомаркера-кандидата для выявления фиброза и ремоделирования миокарда [11][12].

Наиболее интересным биомаркером, отражающим тканевую гипоксию, является индуцируемый гипоксией фактор-1-альфа (HIF-1α, Hipoxia inducible factor-1α), за открытие и изучение которого группе Semenza GL в 2019г была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине [13]. HIF-1α — это транскрипционный фактор, активирующийся в условиях гипоксии и запускающий экспрессию генов, продукция которых позволяет адаптироваться к условиям недостатка кислорода [14]. Кроме того, данное соединение рассматривают как фактор, связывающий СНсФВ и ожирение, при этом гиперсекреция HIF-1α жировой тканью приводит к повышению экспрессии профибротических факторов, ускоряющих кардиофиброз и ухудшающих диастолическую функцию [15].

Цель работы: оценить взаимосвязи сывороточных концентраций биохимических маркеров ремоделирования миокарда и клеточной гипоксии (CILP-1 и HIF-1α) с клинико-инструментальными показателями у пациентов с СНсФВ и в контрольной группе.

Материал и методы

В исследование включено 47 пациентов с диагнозом СНсФВ в возрасте от 47 до 79 лет (медиана 67 лет). Контрольная группа лиц без диагноза СНсФВ была сопоставима по полу и возрасту. Каждая группа делилась на две подгруппы в зависимости от индекса массы тела (ИМТ): подгруппа с ИМТ <30 кг/м² и подгруппа с ожирением (ИМТ ≥30 кг/м²). У пациентов с СНсФВ, проходивших лечение в стационаре ФГБУ "НМИЦ терапии и профилактической медицины" Минздрава России в период с мая 2018г по декабрь 2019г, диагноз был верифицирован на основании наличия симптомов и признаков в сочетании с повышением уровня NT-proBNP, ФВ ЛЖ >50% и одним из дополнительных ЭхоКГ-критериев — структурные изменения (увеличение левого предсердия (ЛП), гипертрофия ЛЖ) или наличие диастолической дисфункции.

Критерии включения в группу СНсФВ: подписанное пациентом информированное согласие, возраст от 50 до 80 лет, наличие СНсФВ. Критерии включения в группу контроля: подписанное пациентом информированное согласие, возраст от 50 до 80 лет, отсутствие критериев наличия СНсФВ. Критерии невключения в исследование: СД 2 типа, ИМТ ≥40 кг/м², острое нарушение мозгового кровообращения в течение последних 3 мес., онкологические заболевания и проведенная химиотерапия, лучевая терапия, тяжелый порок клапанов сердца, заболевания, которые сопровождаются симптомами, сходными с таковыми при СН (хроническая обструктивная болезнь легких, бронхиальная астма, анемия — концентрация гемоглобина <90 г/л), тяжелые нарушения ритма и проводимости, требующие электрокардиостимуляции. Общая характеристика выборки представлена в таблице 1.

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами Надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования прошел одобрение локального этического комитета ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России — № 07-08/20 от 26.11.2020.

Всем лицам, включенным в исследование, проводилась трансторакальная ЭхоКГ по стандартному протоколу с расширенной оценкой диастолической функции и рутинные лабораторные общеклинические и биохимические исследования: уровни глюкозы, гликированного гемоглобина, креатинина, скорость клубочковой фильтрации, концентрация NT-proBNP, активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтранспептидазы.

Больные СНсФВ получали лечение по показаниям согласно действующим на момент исследования клиническим рекомендациям в рамках лечения основного заболевания: наиболее часто назначаемой группой препаратов среди пациентов с СНсФВ являлись β-адреноблокаторы (87,2%); в остальном, по структуре назначенной терапии получены следующие данные: диуретики — 80,8%, статины — 61,7%, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента — 53,2%, в равных процентах антагонисты рецепторов ангиотензина II и пероральные антикоагулянты (по 42,5%), антагонисты кальция — 23,4%, антагонисты минералкортикоидных рецепторов — 19,1%, антиагреганты — 12,7%, ингибиторы протонной помпы — 31,9%.

Образцы крови для исследования биохимических маркеров были взяты из кубитальной вены натощак в утренние часы с использованием вакуумной системы для взятия крови (пробирка с гелем и активатором свёртывания, Vacutest KIMA, Италия). Обработку образцов цельной крови проводили методом центрифугирования при 3000 об./мин при 20^° С, полученную сыворотку разливали по 500 мкл в 4 пластиковые пробирки и хранили при -70-80^° С в "Банке биологического материала" ФГБУ "НМИЦ ТМП" Минздрава России. Количественное определение CILP-1 проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора реактивов Human CILP-1 ELISA Kit (RayBiotech, США) с диапазоном измерений 0,053-13,0 нг/мл. Образцы сыворотки крови двукратно разводились согласно инструкции производителя реактивов. Количественное определение HIF-1α проводилось методом высокочувствительного твердофазного ИФА с применением реактивов High Sensitive ELISA Kit for Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha HIF1a (Cloud-Clone, США) с диапазоном измерений 13,3-2000,0 пг/мл. Детекцию оптической плотности (адсорбции) проводили с использованием микропланшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США).

Статистический анализ проводился с использованием среды R 4.2.3 с открытым исходным кодом. Распределение характеристик пациентов представлено долями. Непрерывные переменные описывались медианами (Ме) и интерквартильным размахом [Q25; Q75]. Сравнение двух групп по непрерывному показателю проводилось с помощью U-критерия Манна-Уитни. Выявление корреляционных связей проводилось на основе теста ранговой корреляции Спирмена. Уровень значимости проверяемой гипотезы был принят равным 0,05. Сила корреляции при коэффициенте корреляции Спирмена ρ<0,3 оценивалась как слабая, 0,3-0,7 − как средней силы, >0,7 — как сильная.

Результаты

Проведен сравнительный анализ инструментальных и лабораторных данных между группой больных СНсФВ и группой контроля. Как видно из таблицы 2, группы статистически значимо различались по медианам параметров, полученных при ЭхоКГ-исследовании сердца, за исключением ФВ ЛЖ, а также по медиане уровня NT-proBNP.

Концентрации CILP-1 оказались выше аналитической чувствительности используемого метода во всех пробах. Медиана концентраций CILP-1 в сыворотке крови больных СНсФВ составила 3,24 [ 2,54-4,55] нг/мл и статистически значимо не отличалась от таковой в группе контроля 3,45 [ 2,64-4,70] нг/мл. Сывороточные уровни HIF-1α выше аналитической чувствительности метода были выявлены не во всех пробах, поэтому дополнительно была проанализирована частота выявления данного биохимического показателя. Согласно полученным результатам, частота выявления HIF-1α в сыворотке крови больных СНсФВ с ожирением (ИМТ ≥30 кг/м²) составила 45,5%, у больных СНсФВ без ожирения − 56,0%, тогда как в подгруппе контроля с ожирением частота выявления этого фактора была 27,3 vs 54,5% у лиц контрольной подгруппы без ожирения, однако различия частот выявления показателя между указанными подгруппами не достигли статистической значимости. Количественная оценка HIF-1α показала, что медиана его уровня в группе больных СНсФВ составила 14,3 [ 0,0-19,8] пг/мл vs 7,5 [ 0,0-28,5] пг/мл в группе контроля, но различия не были статистически значимыми.

Проведенный ROC-анализ показал, что площадь под кривой (AUC) для HIF-1α равна 0,461 (пороговое значение 7,17 пг/мл), для CILP-1 AUC=0,54 (пороговое значение 4,12 нг/мл), что не позволяет использовать данные показатели напрямую для разделения обследованной когорты на больных СНсФВ и контрольную группу.

В ходе дальнейшего анализа основная и контрольная группы были разделены на лиц с ИМТ <30 и ≥30 кг/м² (ожирение) с целью поиска корреляций между уровнями биохимических маркеров и доступными количественными показателями ЭхоКГ в каждой описанной подгруппе. В таблице 3 приведены показатели, для которых выявлены статистически значимые корреляционные взаимосвязи с концентрациями изучаемых биомаркеров в сыворотке крови хотя бы в одной из анализируемых подгрупп.

Сывороточный уровень CILP-1 в подгруппе больных СНсФВ с ИМТ <30 кг/м² отрицательно коррелировал с индексированным конечно-систолическим объемом (иКСО) ЛП и продольным размером правого предсердия. В подгруппе больных СНcФВ с ИМТ ≥30 кг/м² (больные с ожирением) выявлена положительная корреляция уровней этого биомаркера с конечно-систолическим размером ЛЖ и отрицательная с иКСО ЛП, при этом обе зависимости были средней силы.

Примечательно, что в контрольной подгруппе с ожирением корреляционная связь между уровнем CILP-1 и конечно-систолическим размером ЛЖ была, напротив, сильной отрицательной; кроме того, была выявлена отрицательная связь между уровнем анализируемого маркера и конечно-систолическим объемом ЛЖ. Наряду с этим для подгруппы контроля с ИМТ ≥30 кг/м² была получена сильная положительная корреляционная взаимосвязь между CILP-1 и поперечным размером ЛП. Концентрация CILP-1 в контрольной подгруппе без ожирения положительно коррелировала только с размерами корня аорты.

Концентрация HIF-1α в сыворотке крови больных СНсФВ без ожирения положительно коррелировала с индексом массы миокарда ЛЖ, который является одним из основных ЭхоКГ-параметров в структуре имеющихся алгоритмов диагностики СНсФВ. В подгруппе больных СНсФВ с ожирением были выявлены статистически значимые отрицательные корреляционные связи уровня HIF-1α с размерами дуги и корня аорты, а также c ударным объемом (УО) ЛЖ. Таким образом, более высокие концентрации HIF-1α соответствовали более низким показателям УО ЛЖ, который характеризует сократительную способность миокарда.

Примечательно, что концентрация биомаркера клеточной гипоксии не была связана ни с одним ЭхоКГ-показателем у лиц контрольной подгруппы без ожирения, тогда как в подгруппе с ожирением была выявлена статистически значимая положительная связь средней силы между уровнем HIF-1α и толщиной межжелудочковой перегородки, а также сильная положительная корреляционная связь (коэффициент корреляции ρ=0,953) с толщиной задней стенки ЛЖ, которые отражают выраженность гипертрофии миокарда ЛЖ. В свете этих данных можно предположить существование компенсаторных механизмов у лиц без СНсФВ, но с ожирением, в ходе развития ремоделирования миокарда на фоне тканевой гипоксии.

Нами не было получено статистически значимых взаимосвязей между сывороточными уровнями изучаемых биомаркеров и возрастом, полом, ИМТ и другими клинико-анамнестическими характеристиками больных, что свидетельствует о независимости концентраций изучаемых биохимических показателей от данных факторов.

Обсуждение

В рамках настоящей работы был проведен сравнительный анализ клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных показателей у пациентов с СНсФВ с целью определить ассоциации уровней CILP-1 и HIF-1α и показателей трансторакальной ЭхоК Г. Так, у пациентов с СНсФВ вне зависимости от ИМТ отмечена отрицательная корреляционная связь концентрации в крови CILP-1 с иКСО ЛП, который является "большим" морфологическим критерием СНсФВ согласно алгоритму HFA-PEFF (Heart Failure Association — P: Pre-test assessment, E: Echocardiography and Natriuretic Peptide Score, F1: Functional testing, F2: Final aetiology) [16]. Известно, что фиброз миокарда является ключевым звеном патогенеза диастолической дисфункции и СНсФВ [17], однако в представленную выборку вошли пациенты с I-II функциональным классом СНсФВ и относительно небольшим увеличением объема ЛП, что дает основания предполагать низкую степень фиброза ЛП в исследуемой группе [18].

К факторам развития структурного ремоделирования миокарда и, как следствие, СНсФВ традиционно относят женский пол, пожилой возраст, наличие артериальной гипертензии, СД, ожирения или избыточной массы тела, ФП, ишемическую болезнь сердца [19]. Небольшой объем выборки, полиэтиологический характер развития СНсФВ и многообразие фенотипов данной патологии могут объяснять отсутствие корреляций с рядом исследованных ЭхоКГ-параметров, считающихся маркерами ремоделирования миокарда.

Результаты исследования HIF-1α показали, что у больных СНсФВ без ожирения уровень биомаркера положительно коррелировал с индексом массы миокарда ЛЖ, который является одним из основных ЭхоКГ-показателей в структуре имеющихся алгоритмов диагностики СНсФВ ("большой" морфологический критерий СН в алгоритме HFA-PEFF) [18], что может отражать значимость тканевой гипоксии в ремоделировании ЛЖ в данной подгруппе. Одновременно с этим получена отрицательная корреляционная связь УО ЛЖ, который характеризует сократительную способность миокарда, с уровнем HIF-1α. Можно полагать, что при нарастании гипоксии усиливается интерстициальный кардиофиброз и, как следствие, усугубляется ремоделирование миокарда, что влечет за собой снижение параметра УО ЛЖ. Интерес представляет и выявленное в настоящей работе наличие положительной связи уровня HIF-1α с толщиной межжелудочковой перегородки и задней стенки ЛЖ, которые отражают выраженность гипертрофии миокарда ЛЖ, что может свидетельствовать о существовании компенсаторных механизмов у пациентов без СНсФВ, но с ожирением до наступления СН [20][21].

Ограничения исследования. Настоящая работа носит пилотный характер и имеет ряд ограничений. Относительно небольшой объем выборки не позволяет провести многофакторный статистический анализ. Используемый метод ИФА для определения HIF-1α обладает ограничениями по аналитической чувствительности, хотя и является самым чувствительным среди доступных в нашей стране стандартизованных тест-систем. Указанные ограничения могут быть преодолены в перспективе в ходе исследования указанных биохимических маркеров на большей выборке с использованием современных диагностических тест-систем и технологий.

Заключение

Поиск неинвазивных лабораторных биохимических коррелятов патогенетических процессов, происходящих при хронических неинфекционных заболеваниях, является сложной и многофакторной задачей. В ходе настоящей работы впервые был проведен комплексный анализ факторов, ассоциированных с CILP-1 и HIF-1α у больных СНсФВ и в контрольной группе лиц без данного заболевания. Согласно полученным данным, концентрации CILP-1 и HIF-1α в сыворотке крови хоть и не различаются в зависимости от наличия СНсФВ, однако демонстрируют связь с рядом ЭхоКГ-параметров, как в подгруппах больных СНсФВ, так и в подгруппах контроля с различным ИМТ. Полученные зависимости потенциально могут отражать патогенетическую роль клеточной гипоксии и ремоделирования миокарда как у больных СНсФВ, так и у лиц с ожирением без СНсФВ и требуют дальнейшего изучения на большей выборке.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.