Зрелые нейтрофилы как маркер гипоэхогенных каротидных атеросклеротических бляшек и предиктор прогрессирования мультифокального атеросклероза

Исследование роли нейтрофилов в атерогенезе активно ведется в последние несколько лет, что во многом связано с прогрессом в изучении фенотипической и функциональной пластичности нейтрофилов [1]. На сегодняшний день предложено несколько различных подходов к описанию гетерогенности нейтрофилов и идентификации отдельных подтипов: фенотипический профиль, стадия жизненного цикла, пролиферативная способность, тканевая локализация, эффекторные функции и т. д. [2]. Важным стимулом для дальнейших исследований гетерогенности нейтрофилов при различных заболеваниях является то, что отдельные подтипы нейтрофилов являются фактором, существенно модифицирующим течение заболевания и его прогноз, что было наглядно показано в экспериментальных и клинических исследованиях рака [3].

В настоящее время описаны различные механизмы участия нейтрофилов на всех этапах развития атеросклероза [4]. В очаге воспаления в сосудистой стенке активированные нейтрофилы осуществляют несколько синергетических стратегий для реализации своих функций: высвобождение протеолитических ферментов, выделение активных форм кислорода, секреция провоспалительных цитокинов и аларминов, формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ), рекрутирование других иммунокомпетентных клеток и т. д. [5]. Вероятно, нейтрофилы играют ключевую роль на этапах роста и дестабилизации атеросклеротической бляшки (АСБ). Рекрутирование циркулирующих нейтрофилов в АСБ происходит особенно активно на продвинутых этапах эволюции АСБ, где они главным образом локализуются в регионах, обозначаемых как "плечи" бляшки [4]. Формируемые нейтрофилами в атероме НВЛ индуцируют гибель гладкомышечных клеток, а секретируемые матриксные металлопротеиназы способствуют ремоделированию и биодеградации экстрацеллюлярного матрикса, результатом чего является увеличение липидно-некротического ядра бляшки, рост атеромы и её дестабилизация [4][6][7].

В целом ряде клинических исследований было показано, что определение сывороточных маркеров активации нейтрофилов, НВЛ и металлопротеиназы может иметь диагностическое значение в отношении выявления нестабильных АСБ [8][9]. Целью нашего исследования являлась оценка диагностической и прогностической ценности циркулирующих зрелых и стареющих нейтрофилов в отношении наличия гипоэхогенных каротидных АСБ и краткосрочного прогрессирования каротидного и мультифокального атеросклероза (МФА).

Материал и методы

В исследование включали мужчин и женщин в возрасте от 40 до 64 лет. Всеми пациентами было подписано информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом (протокол заседания № 10 от 27.10.2018) и был описан нами ранее [10].

Дуплексное сканирование (ДС). Всем пациентам проводили ДС артерий каротидного бассейна и артерий нижних конечностей (АНК) на первом визите и на повторном визите через 12-24 мес. Исследование проводили в B-режиме, режиме цветового картирования, импульсной допплерографии. Определяли следующие показатели бремени каротидного атеросклероза: суммарная высота каротидных АСБ, максимальная высота каротидных АСБ, суммарная площадь каротидных АСБ [11]. Ультразвуковую морфологию каротидных АСБ оценивали по данным GSM-анализа, методика которого была подробно описана нами ранее [12].

Лабораторное исследование. Всем пациентам проводили забор крови в утренние часы натощак. Определяли следующие показатели: общий холестерин, холестерин липопротеидов низкой плотности, холестерин липопротеидов высокой плотности, триглицериды, гликированный гемоглобин, глюкоза (венозная кровь), высокочувствительный С-реактивный белок (вчСРБ) (АО "Вектор-Бест", Россия), мочевая кислота, креатинин (с последующим определением скорости клубочковой фильтрации по формуле CKD-EPI).

Фенотипирование и дифференцировку субпопуляций нейтрофилов осуществляли методом проточной цитометрии на аппарате "Navios 6/2" ("Beckman Coulter", США) с использованием конъюгатов моноклональных антител — CD16-PE-Cy7.0 ("Invitrogen", США), CD11b-FITC, CD62L-PE ("Beckman Coulter", США), CD182 (CXCR2)-PE-Cy5.0, ("BD Biosciences", США), CD184 (CXCR4)-PE-CF594 ("BD Biosciences", США). Фенотипирование нейтрофилов проводили в цельной крови с детекцией не <30 тыс. событий.

Критерии прогрессирования атеросклероза. С целью оценки прогрессирования каротидного атеросклероза по динамике изменения суммарных площади и высоты АСБ проводили расчет ошибки измерения для указанных показателей (проводили измерения указанных показателей у 20 пациентов с интервалом 24-48 ч). Ошибка измерения (σ) была равна трем стандартным отклонениям разницы между двумя измерениями, проведенными с интервалом 24-48 ч [13]. Ошибка измерения суммарной площади АСБ и суммарной высоты АСБ составляла 0,053 см² и 0,16 мм, соответственно. Прогрессированием считали увеличение суммарной площади АСБ и/или суммарной высоты АСБ >2σ, т. е. более чем на 0,106 см² и 0,32 мм, соответственно [13]. Таким образом, критериями прогрессирования субклинического атеросклероза являлись: 1) появление новой АСБ в сонных артериях и/или АНК; 2) увеличение степени стенозирования ранее имеющегося стеноза ≥10%; 3) увеличение суммарной площади каротидных АСБ более чем на 0,106 см² и/или увеличение суммарной высоты АСБ более чем на 0,32 мм.

Статистическая обработка. Анализ статистических данных проводили с использованием программного обеспечения MedCalc (версия 22.016), OriginPro 2024. Качественные данные были представлены в виде частот и процентов. Количественные переменные описывали медианой (Ме) c указанием интерквартильного интервала [ 25-й процентиль; 75-й процентиль]. В целях определения взаимосвязей показателей использовали корреляционный анализ Спирмена. Для оценки значимости различий между двумя группами использовали критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при критическом уровне значимости 0,05. С целью установления пороговых значений исследуемых показателей проводили ROC-анализ с определением чувствительности и специфичности, а также расчетом площади под характеристической кривой (AUC) с 95% доверительным интервалом (ДИ). С целью выявления факторов риска для выживаемости использовали регрессионный пошаговый анализ Кокса. Зависимым (прогнозируемым) признаком при этом считали время до наступления исхода, независимым — изучаемый фактор.

Результаты

В исследование были включены 200 пациентов, удовлетворявших критериям включения, медиана возраста составляла 51,5 лет. Очень высокий сердечно-сосудистый риск (ССР) был установлен у 33 (16,5%) пациентов, высокий — у 32 (16,0%), умеренный — у 84 (42,0%), низкий — у 51 (25,5%) пациента. Клиническая характеристика пациентов представлена в таблице 1.

Результаты ультразвукового исследования артерий каротидного бассейна и АНК представлены в таблице 2.

С целью определения взаимосвязей между количеством циркулирующих нейтрофилов и ультразвуковыми маркерами атеросклероза сонных артерий и АНК был проведен корреляционный анализ, результаты которого представлены на рисунке 1.

Таким образом, не было выявлено взаимосвязей между общим количеством нейтрофилов и ультразвуковыми маркерами атеросклероза периферических артерий. Напротив, абсолютное и относительное количество зрелых нейтрофилов прямо коррелировало с ультразвуковыми индикаторами атеросклероза сонных артерий. Количество стареющих нейтрофилов, в свою очередь, коррелировало со степенью стенозирования АНК.

По результатам анализа взаимосвязей между эхогенностью каротидных АСБ и количеством циркулирующих зрелых и стареющих нейтрофилов были выявлены отрицательные корреляционные взаимосвязи между абсолютными количеством зрелых нейтрофилов и эхогенностью АСБ, которые, однако, не достигали уровня статистической значимости (r=-0,220; p=0,0516). По данным анализа межгрупповых различий в субпопуляционном составе нейтрофилов в зависимости от наличия гипоэхогенных каротидных АСБ (эхогенность ≤40 усл. ед., что соответствует первому квартилю) было установлено, что пациенты с гипоэхогенными каротидными АСБ характеризуются статистически значимо большим абсолютным количеством зрелых нейтрофилов — 3383,0 (2660,2; 3742,0) кл/мкл vs 2633,0 (2031,2; 3245,7) кл/мкл (p=0,0340).

С целью оценки потенциальной диагностической ценности абсолютного количества зрелых нейтрофилов в отношении наличия гипоэхогенных каротидных АСБ был проведен ROC-анализ (рис. 2).

Таким образом, увеличение количества зрелых нейтрофилов >3023,0 кл/мкл позволяло прогнозировать наличие гипоэхогенных каротидных АСБ с чувствительностью 75,0% и специфичностью 69,5% (индекс Юдена 0,4449).

Повторное ДС периферических артерий было выполнено на втором визите с интервалом 15,5 (12,2; 23,5) мес. Прогрессирование каротидного атеросклероза было установлено у 44,0% пациентов, атеросклероза АНК — у 37,3%, МФА — у 22,3% пациентов. По данным анализа межгрупповых различий в субпопуляционном составе нейтрофилов в зависимости от прогрессирования атеросклероза было установлено, что пациенты с прогрессированием каротидного атеросклероза отличались большим абсолютным количеством зрелых нейтрофилов (3034,0 (2353,0; 3582,0) кл/мкл vs 2624,0 (1923,5; 3145,0) кл/мкл, p=0,0140), как и пациенты с прогрессированием МФА (3463,0 (2326,0; 4052,2) кл/мкл vs 2662,0 (2050,0; 3207,0) кл/мкл, p=0,0162). С целью оценки потенциальной диагностической ценности абсолютного количества зрелых нейтрофилов в отношении прогрессирования атеросклероза был проведен ROC-анализ (рис. 3).

По результатам регрессионного анализа Кокса увеличение абсолютного количества зрелых нейтрофилов не было связано со статистически значимым увеличением риска прогрессирования каротидного атеросклероза. Напротив, увеличение количества зрелых нейтрофилов >3223,0 кл/мкл ассоциировалось с увеличением относительного риска (RR) прогрессирования МФА в 3,19 раза (95% ДИ: 1,40-7,25; p=0,0056) в модели без поправки, в 2,62 раза (95% ДИ: 1,11-6,20; p=0,0278) в модели с поправкой на пол и возраст, в 3,09 раза (95% ДИ: 1,34-7,17; p=0,0082) в модели с поправкой на исходный ССР.

Обсуждение

Результаты клинических исследований свидетельствуют о наличии сильных взаимосвязей между количеством нейтрофилов и риском неблагоприятных сердечно-сосудистых событий. Так, по данным исследования CALIBER (cardiovascular disease research using linked bespoke studies and electronic health records), в которое был включен 775231 участник, увеличение количества нейтрофилов в пределах референсных значений было связано с увеличением RR развития сердечной недостаточности (RR 2,04), атеросклеротического заболевания периферических артерий (RR 1,95), аневризмы брюшной аорты (RR 1,72), нефатального инфаркта миокарда (RR 1,58) и коронарной смерти (RR 1,78) [14]. Вместе с тем в 2023г были опубликованы результаты исследования с Менделевской рандомизацией, продемонстрировавшего, что генетически обусловленное увеличение количества циркулирующих нейтрофилов на одно стандартное отклонение ассоциируется с увеличением RR ишемической болезни сердца (RR 1,15; 95% ДИ: 1,08-1,21), инфаркта миокарда (RR 1,22; 95% ДИ: 1,12-1,34) и атеросклеротического заболевания периферических артерий (RR 1,19; 95% ДИ: 1,04-1,36) [15]. Таким образом, впервые были получены убедительные данные о каузальной роли нейтрофилов в развитии атеросклеротических сердечно-сосудистых событий [16]. Другой важной находкой являлось то, что различные гематологические индексы, включающие в себя нейтрофилы, такие как отношение нейтрофилов к лимфоцитам, не имеют дополнительной предиктивной ценности.

Основными результатами проведенного исследования являются: 1) количество зрелых нейтрофилов прямо коррелировало с ультразвуковыми индикаторами атеросклероза сонных артерий, стареющих нейтрофилов — с ультразвуковыми индикаторами атеросклероза АНК; общее количество нейтрофилов не коррелировало с ультразвуковыми индикаторами атеросклероза; 2) пациенты с гипоэхогенными каротидными АСБ отличались большим количеством циркулирующих зрелых нейтрофилов; абсолютное количество зрелых нейтрофилов демонстрировало умеренную диагностическую эффективность в отношении выявления гипоэхогенных каротидных АСБ; 3) пациенты с краткосрочным прогрессированием каротидного и МФА отличались большим количеством циркулирующих зрелых нейтрофилов; увеличение количества зрелых нейтрофилов >3223,0 кл/мкл ассоциировалось с увеличением RR прогрессирования МФА в модели с поправкой на исходный ССР.

Важно отметить, что общее количество нейтрофилов в проведенном исследовании не коррелировало с ультразвуковыми индикаторами бремени атеросклероза и не было связано с увеличением риска прогрессирования атеросклероза. С учетом представленных выше данных о том, что производные от общего количества нейтрофилов гематологические индексы могут иметь крайне ограниченную дополнительную ценность, именно углубленный анализ отдельных подтипов нейтрофилов может быть источником получения дополнительной диагностической и прогностической информации, что также демонстрирует проведенное нами и другие исследования [17].

Зрелые нейтрофилы являются доминирующей субпопуляцией нейтрофилов в системной циркуляции, составляющих в представленном исследовании ~90% от всех нейтрофилов. Вероятно, ассоциации между общим количеством нейтрофилов и атеросклеротическими сердечно-сосудистыми заболеваниями, которые были получены в крупных исследованиях, опосредованы вкладом именно этого подтипа нейтрофилов, и именно они реализуют общие атерогенные эффекты нейтрофилов. Кроме того, именно зрелые и стареющие нейтрофилы, которые зачастую рассматриваются как один из подтипов зрелых нейтрофилов, обладают наибольшей способностью к хемотаксису и миграции в ткани, в т. ч. и АСБ [18]. По мере роста атеромы важность количества циркулирующих нейтрофилов может существенно возрастать, поскольку нейтрофилы отличаются способностью к адгезии к эндотелию и миграции в стенку сосуда даже при высоких значениях напряжения сдвига, рост которого наблюдается по мере увеличения АСБ и степени стенозирования сосуда [19][20]. Таким образом, количество зрелых нейтрофилов может служить маркером потенциально уязвимых АСБ, которые, в свою очередь, также являются предикторами прогрессирования атеросклероза в различных сосудистых бассейнах [21].

Заключение

Среди пациентов 40-64 лет увеличение количества циркулирующих зрелых нейтрофилов ассоциируется с увеличением бремени каротидного атеросклероза и наличием гипоэхогенных каротидных АСБ. Увеличение количества зрелых нейтрофилов >3223,0 кл/мкл ассоциировалось с увеличением RR риска прогрессирования МФА за 15,5 мес. наблюдения в 3,09 раза (95% ДИ: 1,34-7,17; p=0,0082) в модели с поправкой на исходный ССР.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.