Изменение экспрессии изоформ LEPR в локальных жировых депо при коронарном атеросклерозе и приобретенных пороках сердца

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) и аортальный стеноз (АС) являются лидирующими нозологиями среди сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Несмотря на многочисленные исследования, проведенные на протяжении десятилетий, остается ряд нерешенных вопросов, касающихся развития и прогрессирования данных заболеваний [1]. Согласно современной патофизиологической модели ИБС, в основе лежит нарушение баланса между реальным кровоснабжением миокарда и его потребностями, обусловленное в большинстве случаев атеросклерозом коронарных артерий (КА). Молекулярные механизмы атеросклероза представляют собой сложную сеть клеточных событий, которые до конца не изучены. Представления о том, что развитие атеросклероза и заболеваний клапанов сердца взаимосвязано, является предметом дискуссий. Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что стеноз аортального клапана (АК) и атеросклероз имеют общие факторы риска. Кроме того, на начальных стадиях патогенез АС подобен атеросклерозу и характеризуется разрушением базальной мембраны, воспалением, клеточной инфильтрацией, отложением липидов. Впрочем, несмотря на то, что коронарный атеросклероз и стеноз АК имеют схожие патофизиологические предпосылки в отношении инициации, вероятно, существует различный механизм их эволюции.

В результате многочисленных исследований сформировалось предположение о том, что лептин может принимать участие как в ускорении атеросклеротического процесса, так и способствует кальцификации клапанных интерстициальных клеток, а также независимо предсказывает острые сердечно-сосудистые события [2][3]. Точный механизм воздействия лептина на сердечно-сосудистую систему до конца неясен.

Для реализации биологических эффектов лептину необходимо связаться со своими специфическими рецепторами (LEPR), которые широко распространены в центральной нервной системе и периферических органах и тканях [4]. Жировая ткань (ЖТ) является важной мишенью действия лептина посредством аутокринной регуляции за счет наличия как длинной, так и коротких изоформ LEPR [5]. Эффекты лептина на ЖТ могут различаться в зависимости от локализации, типа адипоцитов и включают помимо контроля липидного обмена другие физиологические процессы, такие как адипогенез, термогенез, апоптоз, воспаление, чувствительность к инсулину [6]. Нарушение образования лептин-рецепторного комплекса в ЖТ способствует гипертрофии адипоцитов, избыточному накоплению триглицеридов, повышенной продукции активных форм кислорода (АФК) и провоспалительных цитокинов, снижению деградации лептина и формированию местной лептинорезистентности, что может вносить непосредственный вклад в развитие и прогрессирование ССЗ.

У пациентов с ИБС и приобретенными пороками сердца (ППС) особый интерес представляет изучение экспрессии шести изоформ LEPR в жировые депо сердца. Поскольку эпикардиальная (ЭЖТ) и периваскулярная (ПВЖТ) ЖТ способны претерпевать структурные и функциональные изменения в патофизиологических условиях [7][8]. Понимание того, как уровень экспрессии изоформ LEPR влияет на эффекты лептина в ЭЖТ и ПВЖТ, может дать важные подсказки для понимания патофизиологии ССЗ. Однако в связи с особенностями локализации и трудностями получения образцов ткани у человека такие исследования единичны.

Цель исследования: оценить экспрессию изоформ рецептора лептина в локальных жировых депо сердца у пациентов с ИБС и ППС.

Материал и методы

Исследование проводилось в соответствии c "Правилами надлежащей клинической практики" и соответствовало стандартам локального этического учреждения и принципам Хельсинкской декларации. В исследование включено 120 пациентов с ИБС. Критериями включения служили наличие показаний к коронарному шунтированию (по данным коронарографии), мужской пол, возраст пациента от 18 до 75 лет, подписанное добровольное информированное согласие пациента на участие в исследовании. Критерии исключения: женский пол, отказ пациента от участия в исследовании, возраст пациента >75 лет, наличие сахарного диабета 1 и 2 типа, декомпенсация хронической сердечной недостаточности, не контролируемая артериальная гипертензия, наличие клинически значимой сопутствующей патологии. В группу сравнения вошло 96 пациентов АС, которым планировалась хирургическая коррекция изолированного порока АК, обусловленного дегенеративным повреждением или врожденной аномалией (двустворчатый клапан).

Пациенты с ИБС получали медикаментозную терапию, согласно клиническим рекомендациям по лечению стабильной ИБС (2020г) — гепарин, клопидогрел, аспирин, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, β-адреноблокаторы, блокаторы кальциевых каналов, нитраты, статины; пациенты с ППС также — варфарин (табл. 1).

Во время кардиохирургического вмешательства (коронарного шунтирования или коррекции стеноза АК) были получены биоптаты ЖТ. Образцы подкожной ЖТ (ПЖТ) забирали из подкожной клетчатки нижнего угла средостенной раны, ЭЖТ — из правых отделов сердца (правого предсердия и правого желудочка) — зон наибольшего присутствия ЖТ, ПВЖТ — в области восходящей части аорты.

Суммарную РНК выделяли из ЖТ с использованием набора RNeasy^® Plus Universal Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Оценка количества и качества очищенной РНК производилась на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific) путем измерения поглощения света при 280 нм, 260 нм и 230 нм и расчета 260/280 (А260/280) и 260/230 (А260/280) и 260/230 (А260/280). Целостность РНК определяли электрофорезом в агарозном геле с последующей визуализацией с использованием системы Gel Doc™ XR+ (Bio-Rad, США). Экстрагированную РНК замораживали и хранили при -70^ С.

Одноцепочечную кДНК синтезировали на 96 луночном термоцикле (Applied Biosystems, США) с использованием коммерческого набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости того же производителя. Обратную транскрипцию производили согласно установленной производителем набора программе. Оценку количества и качества синтезированной кДНК производили на спектрофотометре NanoDrop 2000. Образцы замораживали и хранили при -40^ C.

Экспрессию шести изоформ гена рецептора лептина (LEPR1, LEPR2, LEPR2/2, LEPR3, LEPR3/2, LEPR4) с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием анализов экспрессии генов TaqManTM на системе ViiA 7 (Applied Biosystems, США). Структура праймеров представлена в таблице 2. Каждая 20-мкл реакционная смесь содержала 10 мкл TaqManTM Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), 1 мкл TaqManTM Gene Expression Assay (Applied Biosystems) и 9 мкл матрицы кДНК (100 нг кДНК + очищенная вода, с отсутствием нуклеаз), и амплифицировали при следующих условиях термоциклирования: 2 мин при 50^ С, 10 мин при 95^ С и 40 циклов по 15 с при 95^ С и 1 мин при 60^ С. Отрицательный контроль готовили из 20 мкл реакционной смеси без матрицы кДНК для каждого образца. Расчет экспрессии тестовых генов производили по методу Пфаффла и выражали в логарифмической (log10) шкале как многократное изменение относительно контрольных образцов.

Статистическая обработка полученных данных была выполнена с помощью STATISTICA 12 и SPSS 17.0. Характер распределения выборки оценивали с применением теста Колмогорова-Смирнова. Количественные признаки представлены в виде абсолютных значений (n) и относительных значений (%), количественные данные — в виде медианы и значений 25-го и 75-го квартилей, Mе (Q25;Q75). Межгрупповое сравнение зависимых групп с распределением признаков, отличных от нормального, проводили при помощи критерия Фридмана, попарное сравнение — критерием Вилкоксона. При сравнении трех зависимых групп для оценки статистической значимости была применена поправка Бонферрони и установлен новый критический уровень значимости р≤0,013. С целью оценки различий количественных признаков при сравнении двух независимых групп был использован непараметрический критерий U-критерий Манна-Уитни. За уровень статистической значимости считали различия при p<0,05.

Результаты

При изучении экспрессии изоформ гена LEPR в локальных жировых депо было установлено, что минимальные уровни мРНК LEPR у пациентов с ИБС наблюдались в ЭЖТ, у пациентов с ППС — в ПЖТ. Максимальные уровни вне зависимости от нозологии выявлены в ПВЖТ (рис. 1).

При ИБС уровень мРНК гена LEPR1 в ЭЖТ был ниже ПЖТ в 2,1 раза, LEPR2 — в 2,1 раза, LEPR2/2 — в 1,2 раза, LEPR3 — в 2 раза, LEPR3/2 — в 1,1 раза, LEPR4 — в 1,5 раза, соответственно. Экспрессия гена LEPR1 в ЭЖТ была снижена относительно показателей ПВЖТ в 4,7 раза, LEPR2 — в 2,6 раза, LEPR2/2 — в 2,1 раза, LEPR3 — в 3,8 раза, LEPR3/2 — в 1,7 раза и LEPR4 — в 2,1 раза, соответственно (рис. 1 А).

Максимальный уровень мРНК гена LEPR всех шести изоформ был характерен для ПВЖТ у пациентов с ИБС. При сравнении экспрессии гена LEPR вышеперечисленных изоформ между ПЖТ и ПВЖТ статистически значимые различия отсутствовали.

Для пациентов с пороками минимальный уровень мРНК LEPR был характерен для ПЖТ (рис. 1 Б). Так, экспрессия гена LEPR1 в ПЖТ была снижена относительно ЭЖТ в 1,7 раза, LEPR2 — в 3 раза, LEPR4 — в 2,1 раза. Статистически значимых различий в уровне мРНК других изоформ рецептора лептина между ПЖТ и ЭЖТ не выявлено. В группе с ППС экспрессия гена LEPR1 в ПЖТ была ниже ПВЖТ в 2,5 раза (рис. 1 Б). Уровень мРНК LEPR2 в ПЖТ был снижен относительно ПВЖТ в 3,4 раза, LEPR2/2 — в 2,8 раза, LEPR3 — в 1,8 раза, LEPR3/2 — в 1,9 раза, LEPR4 в 2,5 раза, соответственно.

При сравнении уровня мРНК гена LEPR вышеперечисленных изоформ между пациентами с коронарогенной и некоронарогенной патологией было установлено, что экспрессия гена LEPR1 в ЭЖТ в группе ИБС была ниже аналогичного показателя в группе ППС в 1,5 раза, LEPR2 — в 2,8 раза, LEPR2/2 — в 1,5 раза, LEPR3 — в 2,2 раза, LEPR3/2 — в 1,9 раза, LEPR4 — в 2,1 раза (табл. 3).

У пациентов с ИБС экспрессия генов LEPR1 и LEPR2 в ПЖТ была выше аналогичного показателя пациентов с ППС в 2,2 раза и 2,3 раза, соответственно. Статистически значимых различий в уровне мРНК других изоформ LEPR в ПЖТ между группами пациентов не выявлено (табл. 3).

Для пациентов с ИБС была характерна повышенная экспрессия гена LEPR1 в ПВЖТ относительно лиц с АС в 2,1 раза (табл. 3). Статистически значимых различий между другими изоформами LEPR в ПВЖТ между пациентами с коронарогенной и некоронарогенной патологией не выявлено.

Обсуждение

На сегодняшний день данных, касающихся изучения экспрессии изоформ LEPR у пациентов с ИБС и стеноза АК, немного, поскольку большая часть результатов получена при использовании животных и клеточных моделей. У человека идентифицированы шесть вариантов изоформ LEPR, которые были изучены в ходе нашего исследования. В результате установлены как тканеспецифические особенности экспрессии изоформ LEPR, так и различия в зависимости от нозологии. ЭЖТ демонстрирует минимальные уровни мРНК шести изоформ LEPR относительно ЖТ другой локализации в группе пациентов с ИБС. Кроме того, экспрессия шести изоформ LEPR в ЭЖТ у пациентов с ИБС была ниже аналогичных показателей пациентов с ППС. У лиц со стенозом АК наименьшие уровни мРНК LEPR выявлены в ПЖТ, однако лишь изоформы LEPR1 и LEPR2 были ниже, чем у пациентов с ИБС. Экспрессия шести изоформ LEPR в ПВЖТ была максимальной в обеих группах.

LEPR локализован в хромосоме 1 (1p31) и содержит 20 экзонов [9]. Для этого гена описаны несколько вариантов транскрипта, полученных в результате альтернативного сплайсинга (LEPR1, LEPR2, LEPR2/2, LEPR3, LEPR3/2, LEPR4), кодирующие шесть изоформ рецептора лептина. Изоформы LEPR имеют идентичные внеклеточный лиганд-связывающий и трансмембранный домены, представленные 816 и 34 аминокислотами, соответственно. Кроме того, изоформы LEPR имеют одинаковую последовательность первых 29 аминокислот во внутриклеточном домене. Эта последовательность содержит константный мотив box1. Дальнейшая внутриклеточная аминокислотная последовательность генерируется путем альтернативного сплайсинга мРНК LEPR. В зависимости от длины С-конца внутриклеточного домена изоформы рецептора лептина делятся на длинную (LEPR1) и короткие (LEPR2, LEPR2/2, LEPR3, LEPR3/2, LEPR4). Суммарно внутриклеточный домен LEPR1 представлен 302 аминокислотами на С-конце и имеет дополнительные мотивы box2 и box3. Поскольку изоформы LEPR не обладают собственной ферментативной активностью, дополнительные мотивы в LEPR1 необходимы для активации цитоплазматической тирозинкиназы, называемой янус-киназой 2 (JAK2), и дальнейшей передачи сигналов. Внутриклеточные домены LEPR2, LEPR2/2, LEPR3, LEPR3/2, LEPR4 короче и содержат от 32 до 40 аминокислот [9].

Эффект, наблюдаемый после взаимодействия лептина с рецептором, во многом определяется тем, с какой изоформой LEPR связался гормон. При образовании комплекса лептина с LEPR1 запускается как основной сигнальный путь JAK2/STAT3, так и дополнительные — фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) в центральной нервной системе и периферических тканях [10][11]. В результате стимулируется выработка анорексигенных пептидов, подавление потребления пищи и увеличение затрат энергии. Короткие изоформы LEPR выступают в роли переносчиков лептина через гематоэнцефалический барьер и в опосредовании лизосомальной деградации лептина.

Изоформы LEPR обнаружены в большинстве тканей, в т. ч. в жировой [6]. Поскольку адипоциты экспрессируют рецепторы лептина, лептин может оказывать прямое влияние на развитие и функцию ЖТ. В исследовании Bornstein SR, et al. (2000) было продемонстрировано, что инкубация адипоцитов in vitro в присутствии физиологических концентраций лептина способствовала активации пути JAK2/STAT3 [12]. Путь JAK2/STAT3 участвует в дифференцировки адипоцитов, регулируя транскрипцию CCAAT-энхансер-связывающих протеинов β (C/EBPβ) [13]. Уменьшение длинной изоформы LEPR в ЭЖТ у пациентов с ИБС и в ПЖТ у пациентов с ППС может приводить к нарушению ранних стадий адипогенеза. Снижение дифференцировки жировых клеток-предшественников приводит к избыточному накоплению триацилглицеролов в зрелых адипоцитах. Адипоциты подвергаются клеточной гипертрофии. Увеличенные жировые клетки выделяют избыток свободных жирных кислот (СЖК), АФК и провоспалительных цитокинов. Чрезмерный приток СЖК из эпикардиальных адипоцитов проникает в адвентицию и способствует накоплению липидов в атеросклеротических бляшках КА [14]. Воспаление ЭЖТ может вызывать дисфункцию в прилежащих тканях, приводя к нарушению микроциркуляции миокарда, к повышенной жесткости сосудов и дилатации левого предсердия [15]. Снижение способности адипоцитов к дифференцировке наряду с гипертрофией в ПЖТ у пациентов с ППС может вызвать воспаление и окислительный стресс в данном жировом депо. Однако из-за особенностей расположения не оказывает непосредственного влияния на сердечно-сосудистую систему. Кроме того, провоспалительная активность и производство АФК в ПЖТ ниже, чем в ЭЖТ [16].

Гипертрофия адипоцитов у пациентов с ИБС может быть также обусловлена снижением выработки оксида азота (NO). При связывании лептина с рецептором в ЖТ повышается активность синтазы NO посредством сложного механизма, включающего PKA (протеинкиназу A) и p42/44 MAPK (митоген-активируемую протеинкиназу), стимулирующую продукцию NO. NO ингибирует синтез глицерина, уменьшает вероятность повторной этерификации жирных кислот, снижает накопление липидов в адипоцитах [17]. Замедленная экспрессия LEPR1 в ЭЖТ у пациентов с ИБС, приводит к уменьшению продукции NO, индуцируя гипертрофию адипоцитов. Поскольку высвобождение лептина зависит от размера адипоцитов, уровень лептина в ЭЖТ повышается и может диффундировать непосредственно в стенки миокарда. Хроническое воздействие лептина способствует гипертрофии и фиброзу кардиомиоцитов, потенцируя дисфункцию миокарда.

Нарушение дифференцировки и гипертрофия адипоцитов, обнаруженные при снижении LEPR1, вызывают дефект доставки транспортера глюкозы типа 4 (GLUT4) к плазматической мембране, и, вероятно, являются одной из причин развития инсулинорезистентности (ИР) в ЖТ [18]. Второй причиной формирования ИР может быть гиперпродукция фактора некроза опухоли-α (ФНО-α). Так, в исследовании Huan J-N, et al. (2003) установлено, что дефицит длинной изоформы LEPR в ЖТ мышей TKO-OBR сопровождается увеличением ФНО-α [19]. ФНО-α индуцирует резистентность к инсулину за счет прямого негативного вмешательства в сигнальный путь инсулина, фосфорилирования IRS1, а также изменяя дифференцировку и метаболизм адипоцитов. В результате подавляется несколько важных метаболических эффектов инсулина, таких как стимуляция транспорта глюкозы в клетку, липогенеза, а также ингибирование изопротеренол-индуцированного липолиза. Увеличивается накопление энергии в ЖТ, которое приводит к повышенному выходу СЖК в кровоток, способствуя ускорению атеросклеротического процесса [20].

Основная функция коротких изоформ LEPR связана с интернализацией и деградацией лептина [9]. Снижение экспрессии пяти коротких изоформ LEPR в ЭЖТ у пациентов с ИБС, может приводить к снижению деградации лептина в данном жировом депо и увеличению его содержания. Таким образом, ЭЖТ возможно будет являться альтернативным источником лептина у пациентов с ИБС, способствующим развитию гиперлептинемии. Поскольку повышенный уровень лептина на сердечно-сосудистую систему оказывает действия, которые потенциально являются атерогенными, тромботическими и ангиогенными, снижение как длинной, так и коротких изоформ LEPR в ЭЖТ у пациентов с ИБС может способствовать прогрессированию ССЗ и развитию неблагоприятных сердечно-сосудистых событий.

Заключение

Для пациентов с ИБС характерно выраженное снижение экспрессии шести изоформ LEPR в ЭЖТ. Снижение экспрессии изученных изоформ LEPR в ЭЖТ ассоциировано с нарушением адипогенеза, гипертрофией адипоцитов, формированием ИР, усилением провоспалительных факторов, гиперлептинемией, прогрессированием атеросклероза. Выявленные особенности ЭЖТ у пациентов с ИБС, вероятно, могут оказывать как местное, так и системное негативное влияние на сердечно-сосудистую систему.

Отношения и деятельность. все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.