Полиморфизм генов и сывороточные уровни некоторых ангиогенных факторов роста и про- и противовоспалительных цитокинов у пациентов с постинфарктным ремоделированием сердца

На сегодняшний день эффективность методов своевременного восстановления кровотока при инфаркте миокарда (ИМ) не вызывает сомнений [1]. Однако, несмотря на проведение всего комплекса мероприятий, направленного на ограничение зоны некроза, часть пациентов подвержена развитию патологического постинфарктного ремоделирования сердца, что, в свою очередь, определяет ухудшение эпидемиологического тренда и увеличение распространенности хронической сердечной недостаточности (СН) в структуре сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Общеизвестно, что хроническая СН поддерживает высокую коморбидность населения, ассоциирована с повышенной летальностью и частыми госпитализациями, создавая огромную экономическую нагрузку на систему здравоохранения [2][3].

В классическом понимании процесс ремоделирования левого желудочка (ЛЖ) характеризуется нарушением нормальной архитектоники сердца, прогрессирующей дилатацией камер и снижением глобальной сократительной функции ЛЖ. На протяжении полувека активного изучения проблемы постинфарктного ремоделирования было доказано, что нарушение согласованной работы, дисбаланс про- и противовоспалительных маркеров и персистенция хронического асептического воспаления имеют фундаментальное значение в восстановительной регенерации миокарда [4]. При этом в эксперименте и клинических исследованиях при одинаковом объеме ишемического повреждения миокарда между пациентами продемонстрирована вариабельность характера, выраженности и длительности воспаления, что явилось основанием дальнейшего изучения механизмов, регулирующих синтез белковых молекул, участвующих в воспалении [5].

Последние годы предметом активного изучения являются гены, которые в совокупности с общепризнанными факторами риска ССЗ оказывают влияние на развитие, характер и течение заболевания. В настоящее время хорошо известно, что гены цитокинов отличаются высокой степенью полиморфизма. Полиморфизм в генах цитокинов оказывает влияние на эффективность транскрипции, стабильность и качество мРНК, а также функциональную активность белковых продуктов [6]. В исследованиях последних лет сообщается возможная связь полиморфизма генов с цитокиновой дисрегуляцией при постинфарктной регенерации миокарда и показывается необходимость в проведении клинических исследований для полного раскрытия индивидуальных особенностей иммунного воспаления при ИМ [7].

Так, недавно при исследовании крупной выборки пациентов была обнаружена ассоциация изоформы D сосудисто-эндотелиального фактора (VEGF-D) и полиморфных вариантов его гена с неблагоприятным прогнозом после острого коронарного события [8]. VEGF-D является одним из основных регуляторов лимфоангиогенеза, фиброгенеза и апоптоза. В исследованиях последних лет все чаще подчеркивается роль лимфоангиогенеза в процессе постинфарктного заживления миокарда. Считается, что подавление лимфоангиогенеза при ИМ замедляет элиминацию маркеров воспаления, связано с большей макрофагальной инфильтрацией и способствует затяжному течению воспаления [9].

Ранее в проведенном нами исследовании установлена прогностическая роль интерлейкина-10 (IL-10), фактора роста фибробластов (FGF) и сосудисто-эндотелиального факторов роста (VEGF) в отдаленном постинфарктном периоде у пациентов с ИМ с подъемом сегмента ST (ИМпST) [10]. Таким образом, представляет интерес изучение генетических механизмов, в частности, полиморфизмов генов белков, показавших свое значение в неблагоприятное течение ИМ [11].

Целью исследования является изучение полиморфных вариантов генов IL10, FGF2, VEGFD, TRAIL, SELE, TNFA, TNFβ и TNFRSF1B у пациентов с первичным ИМпST и их значимость в развитии позднего постинфарктного ремоделирования сердца.

Материал и методы

В исследование включено 74 пациента с первичным ИМпST, госпитализированных в ОНК НИИ Кардиологии Томского НИМЦ с 2019 по 2021гг. Диагноз ИМпST устанавливали в соответствии с четвертым универсальным определением ИМ: наличие клиники ишемии миокарда, элевация сегмента ST на электрокардиограмме не менее чем в двух смежных отведениях и повышение уровня высокочувствительного тропонина I >99-го перцентиля верхней границы нормы [12]. У всех пациентов в среднем через 60 (40; 80) мин было выполнено чрескожное коронарное вмешательство с восстановлением антеградного кровотока в симптом-зависимой коронарной артерии. Всем пациентам в соответствии с современными клиническими рекомендациями назначали двойную антитромбоцитарную терапию (100%), статины (100%), блокаторы ренин-ангиотензиновой системы (99%) и бета-блокаторы (96%).

Критерии включения в исследование: первичный ИМпST, возраст старше 18 лет и постоянное проживание на территории Томской области. Более 95% включенных в исследование пациентов — русские.

Критериями невключения были: кардиогенный шок, аутоиммунные, онкологические заболевания, терминальная хроническая болезнь почек, фибрилляции/трепетания предсердий, гемодинамически значимые клапанные пороки сердца и выраженные когнитивные дисфункции.

Протокол исследования отвечал требованиям Хельсинкской декларации и был одобрен локальным этическим комитетом НИИ Кардиологии. Всеми пациентами подписано информированное согласие на участие в исследовании, в т. ч. и на проведение генетического тестирования.

Для проведения генетического исследования всем пациентам на 1 сут. ИМ проводили забор венозной крови из периферической вены. Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови проводилось фенол-хлороформным методом.

В качестве контроля привлечена популяционная выборка русских г. Томска (136 индивидов), сформированная из образцов ДНК "Биобанка населения Северной Евразии" НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ.

Молекулярно-генетическое исследование выполнено на базе Центра коллективного пользования научно-исследовательским оборудованием и экспериментальным биологическим материалом "Медицинская геномика" НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ РАН. Генотипирование выполнялось с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (real-time PCR) по технологии TaqMan с использованием олигонуклеотидных зондов FAM/HEX — BHQ1 (ООО "ДНК-Синтез", Москва) комплементарных региону, содержащему анализируемый фрагмент, либо методом ПЦР-ПДРФ (табл. 1).

Исследование сывороточных уровней белковых молекул (TNF-α, FGF, IL-10 и ТRAIL) проводили с использованием системы Multiplex Instrument FLEXMAP 3D (Luminex Corporation), диагностической панели MILLIPLEX map Human Cytokine/Chemokine Panel II и программного обеспечения MILLIPLEX Analyst 5.1 (MerckKGaA, Milliplex, Германия) в четырех временных точках: на 1, 7 сут. ИМ, через 6 и 12 мес.

Для оценки структурно-функциональных характеристик миокарда ЛЖ в 1, 7 сут. болезни и через 12 мес. была выполнена трансторакальная двухмерная 2D-допплер-эхокардиография на аппарате GE Vivid E9 c электрокардиографической синхронизацией и использованием матричного датчика с частотой 1,7-4,6 МГц (М5S). Измерение объемных параметров и фракции выброса ЛЖ проводилось модифицированным методом Симпсона.

По приросту конечного-диастолического объема ЛЖ на >15% [13] к 12 мес. постинфарктного периода больные были разделены на две группы: с дезадаптивным ремоделированием ЛЖ (РЛЖ+) и без него (РЛЖ-).

Анализ полученных данных проводили в пакете программ STATISTICA 10.0. Проверку нормальности распределения количественных переменных осуществляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Сравнение частот выбранных маркеров между исследуемой и контрольной группой проводилось с помощью критерия χ² с поправкой Йейтса. Статистическую значимость различий количественных переменных в трех и более независимых группах оценивали с использованием критерия Краскела-Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Средний возраст пациентов составил 60,7±10 лет. Количество лиц мужского пола значимо преобладало в группе пациентов с РЛЖ+. Частота встречаемости других традиционных факторов риска ишемической болезни сердца (ИБС) (артериальной гипертензии, сахарного диабета, курения, ожирения) в группах была одинаковой. Клинико-демографическая характеристика пациентов и показатели рутинных лабораторных анализов подробно описаны ранее [14]. Патологическое РЛЖ в отдаленном постинфарктном периоде чаще встречалось у мужчин, было связано с передней локализацией инфаркта и его трансмуральным характером повреждения. Данные рутинных лабораторных анализов свидетельствовали о более выраженном остром миокардиальном повреждении и системной воспалительной реакции в виде значимого повышения тропонина I, натрийуретического пептида, лейкоцитов, С-реактивного белка, печеночных трансаминаз и креатинина в раннем постинфарктном периоде в группе больных с РЛЖ [14].

Распределение частот генотипов в группах соответствовало равновесию Харди-Вайнберга, кроме rs5353 в гене SELE пациентов за счет недостатка гетерозигот.

Для трех изученных SNP (rs1800629 в гене TNF, rs5353 в гене SELE и rs6632528 в гене VEGFD) показаны статистически значимые различия по частотам аллелей/генотипов между исследованными группами (табл. 2 и 3).

Так, по rs1800629 в гене TNF зарегистрированы статистически значимые различия по частотам аллелей (p=0,029). Рисковым является частый аллель G (отношение шансов (ОШ) 2,37; 95% доверительный интервал (ДИ): 1,08-5,43; χ²=4,75; p=0,029), рисковый эффект реализуется через гомозиготный генотип GG (ОШ 2,63; 95% ДИ: 1,10-6,55; χ²=4,92; p=0,026), гетерозиготный генотип является протективным (ОШ 0,37; 95% ДИ: 0,14-0,94; χ²=4,48; p=0,034) (рис. 1).

По rs5353 в гене SELE выявлены статистически значимые различия между частотами генотипов контрольной выборки и группы больных (p=0,004). Генотип СС является рисковым по отношению к ИМ (ОШ 6,93; 95% ДИ: 1,68-32,98; p=0,003 (p_f=0,002)), см. рисунок 2.

Поскольку ген VEGFD расположен на Х-хромосоме, анализ проводился для мужчин и женщин отдельно (табл. 3). У женщин по rs6632528 в гене VGEFD обнаружены статистически значимые различия между частотами генотипов контрольной выборки и группы больных (p=0,017). При этом генотип TT обладает протективным действием, по отношению к развитию ИМ (ОШ 0,32, 95% ДИ: 0,10-0,96; χ²=4,18; p=0,041), а генотип CT предрасполагает к развитию ИМ (ОШ 4,23; 95% ДИ: 1,35-13,53; χ²=6,66; p=0,010) (рис. 3). Однако к этим результатам следует относиться с осторожностью, т. к. в исследованной группе только 24 женщины.

Несмотря на то, что подгруппы, дифференцированные по наличию/отсутствию РЛЖ по частотам генотипов в ряде случаев, отличались на 14-18% (рис. 4), статистически значимых различий не зарегистрировано, что может объясняться малым размером выборки РЛЖ+ (19 человек). Выявленные для общей группы пациентов ассоциации с rs5353 в гене SELE и rs1800629 в гене TNF регистрируются и для группы без РЛЖ (рис. 5). Так, показан рисковый эффект генотипа СС для развития ИМ без последующего РЛЖ (ОШ 8,67; 95% ДИ: 2,03-42,45; χ²=11,04; p=0,00089 (p_f=0,00084)). Следует отметить, что частота аллеля С в подгруппе РЛЖ+ и контрольной выборке практически не отличаются (21,05% и 20,22%), в то время как в группе РЛЖ- эта величина составляет 30%, патологический эффект аллеля С реализуется только через гомозиготный генотип (частота гетерозиготного генотипа у пациентов ниже, чем в контроле (табл. 4, рис. 4). Соответственно, генотип СС rs5353, с одной стороны, предрасполагает к развитию ИМ, в то же время с другой стороны, способствует более благоприятному течению восстановительного постинфарктного периода.

Определение сывороточных уровней цитокинов IL-10, TRAIL и ангиогенного фактора роста — FGF-2 методом мультиплексного анализа показало, что у всех пациентов медиана исследуемых белков во всех временных точках находились в пределах референсных значений. Тем не менее необходимо отметить, что определены более высокие значения IL-10 на 7 сут. (p=0,009), TRAIL в 1 сут. (p=0,009), на 6 (p=0,04) и 12 мес. (p=0,02) ИМ у пациентов с РЛЖ+ в сравнении с пациентами без него. Статически значимого межгруппового различия в концентрациях VGEF и FGF во всех точках исследования не было выявлено.

Сравнение концентраций биомаркеров в зависимости от распределения генотипов полиморфных вариантов генов показало более высокие уровни IL-10 rs3024492 на 7 сут. ИМ и через 6 мес. у носителей генотипа A/T, а также FGF к 6 мес. ИМ у гомозиготных носителей минорного аллеля T rs13122694 (табл. 5). Значимого различия в значениях TRAIL между исследуемыми генотипами TRAIL rs432821 не обнаружено.

При анализе данных эхокардиографии обнаружена зависимость основных показателей ЛЖ от распределения генотипов полиморфизма rs3024492 IL10, rs13122694 FGF2 и rs4830939 VGEFD. В 1 сут. ИМ у носителей гетерозиготного генотипа A/T rs3024492 IL10 контрактильная функция ЛЖ была хуже в сравнении с носителями генотипа T/T. Подобно этому гомозиготное носительство генотипа T/T rs13122694 FGF2 характеризовалось лучшей сократительной функцией миокарда: более высокими показателями фракции выброса ЛЖ, продольной глобальной деформации ЛЖ и меньшими значениями конечно-систолического индекса ЛЖ в раннем постинфарктном периоде. В отдаленном постинфарктном периоде зависимость структурно-функциональных показателей ЛЖ от генотипов только у полиморфизма rs4830939 VEGFD. Так, пациенты с генотипами T/T отличались большей степенью дилатации ЛЖ, чем носители генотипа C/C и C/T (табл. 6).

Обсуждение

Клинико-лабораторная характеристика проанализированной выборки соответствовала "классическому" портрету пациента с патологическим постинфарктным РЛЖ: преобладание в гендерной структуре лиц мужского пола, переднего Q-образующего ИМ, больший объем повреждения миокарда и более выраженный системный воспалительный ответ. Вклад перечисленных факторов в формировании РЛЖ по дилатационному типу подтверждается ранее проведенными исследованиями [15].

Известно, что хроническая коронарная болезнь относится к заболеваниям, развитие которых имеет многофакторную природу. На сегодняшний день результаты ассоциативных исследований предлагают целый ряд генов-кандидатов, предрасполагающих к развитию ИБС и его клинических форм, включая полиморфные варианты генов цитокинов, факторов адгезии, системы гемостаза, липидного обмена, которые в совокупности со средовыми факторами оказывают влияние на естественное течение заболевания и определяют исход болезни. Одним из потенциальных ключевых факторов, ответственных за вариабельность степени иммунного воспаления между индивидами в популяции при ИМ, является полиморфизм генов факторов воспаления.

В нашем исследовании из всех изученных маркеров ассоциацию с развитием ИМпST показали три маркера — rs1800629 TNFA, rs5353 SELE и rs6632528 VEGFD.

Полиморфный вариант rs1800629 -308G/A TNFA — один из широко изученных генетических маркеров, показавших свое значение в развитии ИМ и СН. Считается, что транзиция гуанина на аденин в положении -308 приводит к усилению экспрессии TNFA, синтезу молекул эндотелиальной адгезии лейкоцитов и фактора активации тромбоцитов, создавая условия для развития атеротромбоза [16][17]. Данные о взаимосвязи минорного аллеля A с риском развития ИМпST противоречивы, как и в случае многих других низкополиморфных маркеров. Так, в исследовании Коненкова В. И. и др., так же как и в настоящем исследовании, показан протективный эффект гетерозиготного генотипа, но в качестве рискового (в отличие от наших результатов) выступает генотип AA [18]. В проведенном нами ранее исследовании выявлена ассоциации сочетания генотипов LTA/TNF с ИБС, рисковое сочетание включало в себя генотип GG гена TNF [19]. В то же время в исследованиях Biswas S, et al. [16] и Zeybek U, et al. [17] гетерозиготный генотип и гомозиготный по редкому аллелю преобладают у пациентов с ИМпST. В отечественной литературе данная взаимосвязь показана на 2012 пациентах регистра Оракул I и II, в котором носительство редкого аллеля A rs1800629 явилось одним из независимых предикторов неблагоприятного исхода после перенесенного острого коронарного события (доля больных с острым коронарным синдромом (ОКС) с подъемом сегмента ST 36,8%) [20]. Несколько иные результаты получены в работе Голышко В. С. и др., в которой носительство генотипа GG было связано с более высокой концентрацией TNF-α, чем у больных с гетерозиготным генотипом G/A и объясняется большей физиологической стабильностью экспрессии гена ввиду наличия мутантного и исходного аллеля в генотипе [21]. Напротив, в работе Зыкова М. В. и др. носительство генотипа АА было ассоциировано с большей экспрессией гена и высокими значениями цитокина, хотя частота носительства аллеля А между исследуемой и контрольной группами не отличалась [22]. Противоречивость данных может объясняться популяционными особенностями распределения частот аллелей, даже незначительные изменения которых для низкополиморфных локусов могут иметь критическое значение.

Процесс адгезии лейкоцитов к клеткам эндотелия и их трансэндотелиальная миграция является одним из первых этапов характерного для атерогенеза местного воспаления. Данный процесс запускается чрезмерной экспрессией на поверхности клеток эндотелия молекул межклеточной адгезии — ICAM-1 и молекул адгезии сосудистых клеток — VCAM-1, P- и E-селектинов. В свою очередь, Е-селектин способствует рекрутированию полиморфно-ядерных лейкоцитов, миелоидных клеток и Т-лимфоцитов в очаг воспаления [23]. Ген Е-селектина расположен на хромосоме 1q22-q25 и состоит из 13 экзонов. Из всех изученных полиморфизмов SELE только единицы показали свою связь с коронарной болезнью сердца и ИМ. Наиболее изученным полиморфизмом SELE в отношении риска ИБС является 128Arg. В частности, с риском развития ИМ были связаны rs5361 (561 A/С) и G98T (rs1805193) [24][25]. Влияние генотипа C/C rs5353 на риск развития ИМ в нашей работе показано впервые.

Семейство VEGF представлено из четырех различных изоформ: VEGF-A, B, C, D, каждая из которых, взаимодействуя с соответствующими рецепторами, реализует свои функции: ангио-лимфопролиферация, фиброгенез и подавление апоптоза. Описано, что при ИМ указанные изоформы отличаются между собой разными пространственно-временными характеристиками. В частности, в первые часы и дни ИМ усилена преимущественно экспрессия VEGFA, затем в последующие дни и в отдаленном периоде — VEGFD, которому отводится функция регуляции лимфоангиогенеза, фиброгенеза и апоптоза [26]. Большинство исследований полиморфизма генов ангиогенных факторов роста направлены на поиск ассоциации с неопластическими заболеваниями.

В последнее время в литературе все чаще обсуждается роль лимфатической системы в постинфарктной восстановительной регенерации миокарда. Описано, что лимфоангиогенез способствует своевременной элиминации избытка медиаторов воспаления и тем самым ослабляет интенсивность воспаления в миокарде. Одним из ключевых регуляторов данного процесса является VEGF-D. К примеру, на мышиной модели подавление лимфопролиферации через блокирование рецепторов VEGFR3 приводило к уменьшению лимфы, усилению воспаления, гипертрофии и периваскулярному фиброзу миокарда, а также формированию неблагоприятного ремоделирования и прогрессированию систолической дисфункции сердца [26][27]. Кроме того, подавление лимфоангиогенеза ассоциировалось с меньшей степенью макрофагальной инфильтрации в ткани миокарда. В 2023г опубликован результат крупного исследования, направленного на выявление связи изоформ VEGF и полиморфизма их генов с исходами после острого коронарного события. Проанализированы пациенты с ОКС из исследований PLATO, а в качестве группы контроля выбраны пациенты из исследования STABILITY [8]. Выявлено, что концентрация VEGF-D в плазме и полиморфизмы VEGFD независимо связаны с худшим исходом у пациентов с ОКС и хроническим коронарным синдромом. В нашем исследовании ассоциации между частотами встречаемости SNP VEGFD и риском развития неблагоприятного ремоделирования не установлено. Тем не менее выявлена взаимосвязь носительства генотипа ТТ VGEF rs4830939 с большей степенью дилатации ЛЖ через 12 мес. после ИМпST.

IL-10 — широко изученный цитокин с противовоспалительной активностью. Ген IL10 локализован в хромосомном сегменте 1q31-32. Полиморфизм rs1800872 относится к наиболее изученным полиморфным вариантам IL10. Сообщается его связь с риском развития ИБС, ИМ, а также в единичных работах описана связь генотипа СС с повышенной концентрацией белка в сыворотке [16]. У носителей генотипа A/C rs3024492 большая дилатация ЛЖ и худшая сократительная функция ЛЖ в первые сутки ИМ несколько противоречат функциональным свойствам данного гена. С другой стороны, полученную закономерность косвенно можно интерпретировать как защитную реакцию в ответ на высокую степень повреждения миокарда и воспаление. Напротив, в случае носительства минорного аллеля T эхокардиографическая картина отличалась более сохранной сократительной функцией ЛЖ, при этом из 9 носителей генотипа T/T в течение одного года вторичная конечная точка в виде повторного ИМ достигнута только у одного пациента. Ранее исследований по выявлению связи интронного полиморфизма rs3024492 с ССЗ не проводилось.

Большинство исследований по частотам распределения полиморфных вариантов FGF2, как и у большинства ангиогенных факторов роста, посвящены неопластическим заболеваниями. Ген FGF2 находится в локусе 4q25-q27. Исследований по выявлению взаимосвязи полиморфных вариантов генов с постинфарктным РЛЖ не найдено. В нашем исследовании выявлена зависимость сывороточного уровня FGF-2 на 6 мес. после ИМ от генотипов rs13122694 в гене FGF2 генотипа T/T rs13122694 с уровнем FGF-2 в крови на 6 мес. ИМ. Более высокие концентрации FGF-2 и более высокие показатели сократительной функции ЛЖ в первые сутки ИМ могут свидетельствовать о протективном действии генотипа T/T.

TRAIL — лиганд, идуцирующий апоптоз. По последним данным на мышиной модели также показано как его прямое повреждающее действие на кардиомиоциты, так и опосредованное, через активацию рекрутирования лейкоцитов, миграции макрофагов, экспрессии и секреции провоспалительных цитокинов при реперфузионно-ишемическом повреждении миокарда и усиление интенсивности асептического воспаления в инфарцированном участке миокарда. Ранее проведенные работы продемонстрировали связь данного маркера с СН и частотой неблагоприятных исходов после ИМ [28]. В нашем исследовании у пациентов с РЛЖ обнаружены были высокие концентрации TRAIL. Связи с уровнями белков и эхокардиографических параметров в зависимости от распределения генотипов не найдено. Ранее связь полиморфизма TRAIL с ССЗ не исследовалось. В основном работы посвящены изучению связи полиморфных вариантов TRAIL с онкологическими и аутоиммунными заболеваниями.

В настоящем исследовании выявлены ассоциации полиморфизма генов TNF, SELE, VEGFD с ИМпST. Кроме того, зарегистрировано влияние изученных SNP в генах IL10 и FGF2 на уровень соответствующих белковых продуктов этих генов. Помимо этого, выявлены ассоциации полиморфизма генов Il10, FGF2, VEGFD с основными эхокардиографическими параметрами.

Ограничения исследования. Настоящее исследование является "пилотным", в которое включено 74 пациента. Для получения более убедительных данных требуется проведение анализа на выборке большего размера.

Заключение

Таким образом, у больных с первичным ИМпST, проживающих на территории Томской области, показан вклад полиморфизма генов системы воспаления в формирование предрасположенности к ИМпST — как на уровне фенотипа в целом, так и на уровне формирования отдельных признаков.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.