Постгеномные аспекты резистентности к ацетилсалициловой кислоте у пациентов с ишемической болезнью сердца

Проблема развития повторных сердечно-сосудистых событий после коронарной реваскуляризации остаётся актуальной, несмотря на проводимую вторичную профилактику. Отсутствие ответа и сохранение высокой реактивности тромбоцитов на терапии ацетилсалициловой кислотой (АСК) варьирует от 5% до 60% в зависимости от способа выявления данного феномена [1][2]. В настоящее время нет стандартизованных тестов для оценки функции тромбоцитов в реальной клинической практике. В частности, обсуждается персонализированный подход в оценке геморрагического/ишемического риска при назначении антитромбоцитарной терапии [3]. Большое внимание уделяется поиску предикторов развития резистентности к антитромбоцитарным препаратам, в частности, к АСК, для управления кардиоваскулярными рисками. В качестве предикторов нами ранее описаны генетические факторы — полиморфизмы rs6133, rs6131, rs6136, rs2228315 гена Р-селектина (SELP) [4], клеточные — дезорганизация межклеточного взаимодействия и повышение количества тромбоцит-лейкоцитарных и тромбоцит-тромбоцитарных агрегатов [4] и молекулярные — изменение метаболической активности тромбоцитов по продукции активных форм кислорода [5].

Однако существует структура, играющая важную роль в "проявлении признака" (экспрессии) генов, малоизученная в развитии резистентности к АСК — мРНК. Это чувствительный индикатор биологической активности, в котором изменение паттерна экспрессии генов отражается в изменении биологического процесса.

Предполагаемая гипотеза нашего исследования — у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) уровень экспрессии SELP и количество межклеточных агрегатов могут быть маркерами развития недостаточного ответа тромбоцитов на АСК после коронарного шунтирования (КШ).

Поэтому целью работы стало изучение уровня экспрессии мРНК SELP и уровня межклеточного взаимодействия у пациентов с ИБС до и после КШ при резистентности к АСК.

Материал и методы

В проспективное когортное исследование было включено 65 пациентов с ИБС, у которых по данным коронароангиографии было подтверждено атеросклеротическое поражение коронарных артерий и проведено аорто- или маммарокоронарное шунтирование на базе Федерального центра сердечно-сосудистой хирургии г. Красноярска (ФЦССХ).

Протокол исследования одобрен этическим комитетом КрасГМУ им. В. Ф. Войно-Ясенецкого. Исследование проведено согласно стандартам надлежащей практики и принципам Хельсинкской декларации. Все пациенты подписали информированное согласие об участии в исследовании. Лечение проводилось согласно действующим рекомендациям Российского кардиологического общества (Стабильная ишемическая болезнь сердца, 2020г)¹. Основные группы использованных лекарственных препаратов: антиагреганты (АСК и клопидогрел), ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента/блокаторы рецепторов ангиотензина II, бета-адреноблокаторы, блокаторы кальциевых каналов, статины, диуретики.

Критерии включения пациентов: гемодинамически значимые стенозы ≥2 коронарных артерий при коронароангиографии, стабильная стенокардия напряжения II-IV функциональных классов (ФК) согласно Канадской классификации, подписанное информированное согласие. Критерии исключения: обострение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, хроническая болезнь почек (скорость клубочковой фильтрации <60 мл/мин/1,73 м²), повышение уровня трансаминаз в 3 и более раз, непереносимость или невозможность приема клопидогрела и АСК. В ходе исследования 2 пациента были исключены досрочно, первый — по причине отмены оперативного вмешательства, второй — ввиду летального исхода в послеоперационном периоде (развитие острого инфаркта миокарда).

В числе участников исследования 47% имели II ФК стабильной стенокардии, 42,4% — III ФК при многососудистом поражении коронарного русла. Медиана возраста пациентов составила 64,0 [ 60,0; 67,5] года. Характеристика пациентов представлена в таблице 1.

Для снижения риска геморрагических осложнений за 5 дней до КШ отменялись антиагреганты в соответствии с принятыми стандартами лечения ФЦССХ г. Красноярска. АСК в дозировке 100 мг назначалась с 1-х сут., клопидогрел 75 мг — с 3-х сут. при перенесенном остром коронарном синдроме <1 года назад. 42 пациента находились на монотерапии АСК, 23 — на двойной антиагрегантной терапий — АСК (100 мг) + клопидогрел (75 мг). Также пациенты получали: ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента/антагонисты ренин-ангиотензиновых рецепторов, ингибиторы протонной помпы, бета-адреноблокаторы, статины, антагонисты кальция, нестероидные противовоспалительные средства и наркотические анальгетики в раннем послеоперационном периоде, при наличии сахарного диабета — сахароснижающую терапию.

До и на 8-10-е сут. после КШ выполнялись следующие обследования: развернутый и биохимический анализы крови, оптическая агрегатометрия, определение резистентности к АСК, проточная цитометрия и определение уровня SELP.

Для исследований периферическая кровь из локтевой вены забиралась в пробирку с 3,2% цитратом натрия. Оптический агрегометр CHRONO-LOG 490 применялся для оценки агрегации с использованием индуктора — арахидоновая кислота 1 мМ до и после инкубации с 10 мкл АСК in vitro.

Резистентность к АСК устанавливали при уровне агрегации тромбоцитов с арахидоновой кислотой ≥20%² хотя бы в одной точке наблюдения: при инкубации плазмы пациента с АСК in vitro до КШ без антиагрегантной терапии и на 8-10-й день после операции на фоне антиагрегантной терапии.

С помощью проточного цитометра Navios (BeckmanCoulter, США) измерялось относительное (%) и абсолютное (у. е.) количество межклеточных агрегатов с использованием моноклональных антител: тромбоциты (CD41), моноциты (CD14, CD16), уровень экспрессии Р-селектина на тромбоцитах (CD62P). Применялся забуференный 10% раствор формалина для снижения повышенной агрегации ввиду транспортировки образцов крови в лабораторию для проведения проточной цитометрии.

Для оценки относительного уровня экспрессии SELP использовали РНК, выделенную из тромбоцитов цельной крови с помощью набора реагентов "Рибо-преп" (ООО ИнтерЛабСервис). Предварительно готовили богатую тромбоцитами плазму, магнитные частицы Dynabeads CD45 (ThermoFisherScientific) использовали для очищения образца от примеси лейкоцитов. Концентрации образцов РНК измеряли с использованием набора реагентов Quant-iT™ ssRNA AssayKit и флуориметра Qubit 3 (Invitrogen). С выделенными образцами мРНК (в составе тотальной РНК) проводили совмещенную с обратной транскрипцией ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с использованием набора реагентов "БиоМастер ОТ-ПЦР-РВ" (ООО Биолабмикс). ОТ-ПЦР-РВ осуществляли с использованием специфических праймеров и TaqMan зондов для выявления мРНК SELP и GAPDH (ThermoFisherScientific) в двух технических повторах. Расчет относительного уровня экспрессии SELP осуществляли методом 2-ΔCt, позволяющим провести относительную количественную оценку интересующего гена в сравнении с референсным геном.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью пакета прикладных программ SPSS Statistics (версия 20.0). Для описания полученных данных вычислялись медиана (Ме) и интерквартильный размах (25 и 75 процентили). Для качественных показателей использовались число наблюдений и доля (в процентах) от всех участников или количества пациентов в соответствующей подгруппе. Статистическая значимость различий между показателями независимых выборок оценивалась по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Для категориальных переменных применялся критерий χ². Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Для корреляционного анализа использовался коэффициент Спирмена ρ. Связь считалась статистически значимой при р<0,05. Для прогнозирования вклада каждого из факторов в развитии резистентности к АСК применён метод логистического регрессионного анализа, где использовались бинарные переменные: 0 — чувствительность к АСК, 1 — резистентность к АСК. Введены предикторы: курение, сахарный диабет, ожирение, мультифокальный атеросклероз и экспрессия SELP. Модель считалась статистически значимой при р<0,05 согласно критерию χ² Вальда. Для оценки результатов прогнозирования использовался ROC-анализ. Количественная интерпретация проводилась по ROC-кривым с оценкой показателя AUC (Area under ROC curve — площадь под ROC-кривой): от 0,9 до 1 — отличное качество модели, 0,8-0,9 — очень хорошее, 0,7-0,8 — хорошее, 0,6-0,7 — среднее, 0,5-0,6 — неудовлетворительное качество модели.

Результаты

По итогам проведённого исследования 23,1% (15 человек) были резистентными к АСК до КШ, 29,4% (30 человек) имели устойчивость к АСК хотя бы в одной точке. 7,8% (8 человек) определялись как чувствительные к АСК до КШ, но приобрели резистентность к АСК на 8-10-е сут. после КШ. У 10,8% (11 пациентов) резистентность к АСК определялась как до КШ, так и на 8-10-й день после КШ.

Все пациенты с ИБС разделены на две группы сравнения по наличию резистентности до КШ.

Оценка межклеточных агрегатов и уровня экспрессии SELP в зависимости от чувствительности к АСК показала следующие результаты. У резистентных к АСК пациентов до КШ выявлено статистически значимое повышение уровня экспрессии SELP (0,41 [ 0,28; 0,48] vs 0,32 [ 0,23; 0,39], р=0,037), а также увеличение абсолютного содержания агрегатов моноцит+тромбоцит (24,70 у. е. [ 9,69; 39,90] vs 10,15 у. е. [ 5,27; 30,63], р=0,037) и возрастание относительного количества агрегатов тромбоцит+тромбоцит CD62P (7,37% [ 3,43; 35,49] vs 4,84% [ 0,90; 9,63], р=0,045).

Мы разделили всех пациентов с ИБС на две группы в зависимости от уровня экспрессии мРНК SELP по значению медианы до (0,332 у. е.) и на 8-10-е сут. после КШ (0,396 у. е.). До КШ статистически значимых отличий по количеству клеточных агрегатов в группах не регистрировалось. Во второй точке зафиксировано более высокое количество агрегатов нейтрофил+тромбоцит при уровне SELP 0,396 у. е. и выше (85,80 у. е. [ 33,15; 182,00] и 30,40 у. е. [ 14,08; 130,00], соответственно, р=0,030). То же происходит во второй точке наблюдения с относительным количеством агрегатов нейтрофил+тромбоцит CD62P (88,71% [ 74,03; 100,00] vs 73,47% [ 52,18; 89,79], соответственно, р=0,014).

При измерении уровня агрегационной активности тромбоцитов с арахидоновой кислотой у всех пациентов с ИБС со значением ≥50% статистически значимо повышался относительный уровень агрегатов моноцит+тромбоцит (43,28% [ 27,24; 71,25] vs 40,51% [ 23,96; 62,36], р=0,024).

При проведении корреляционного анализа установлена отрицательная связь между уровнем экспрессии SELP и относительным содержанием агрегатов моноцит+тромбоцит (ρ=-0,349, р=0,013) на 8-10-е сут. после КШ у всех пациентов с ИБС (рис. 1).

Учитывая многофакторный механизм развития резистентности к АСК, мы провели логистический регрессионный анализ для оценки значимости предполагаемых клинико-генетических предикторов в возникновении резистентности к АСК до КШ (табл. 2).

Статистически значимым предиктором, повышающим вероятность развития резистентности к АСК до КШ, является уровень экспрессии SELP (отношение шансов 404,48; 95% доверительный интервал: 1,68-97461,63).

Регрессионная модель развития резистентности к АСК представлена следующим уравнением:

,

где: р — вероятность развития у пациента резистентности к АСК, х1 — уровень экспрессии SELP, е — основание натурального логарифма 2,72.

Модель является статистически значимой (р<0,001) и согласуется с исходными данными по критерию Хосмера-Лемешева (0,795).

Представленная модель даёт самый высокий коэффициент детерминации — 0,125, что отражает статистически значимую вероятность развития резистентности к АСК при повышении экспрессии SELP в 12,5% случаев. Специфичность — 42,9%, чувствительность — 86,4%, площадь под кривой — 0,719 (рис. 2).

Модели с другими показателями, такими как: относительное и абсолютное содержание тромбоцитов CD62P и агрегатов нейтрофил+тромбоцит, моноцит+тромбоцит, тромбоцит+тромбоцит, а также с экспрессией Р-селектина на данных агрегатах, в т. ч. на 8-10-е сут. после КШ — оказались статистически незначимыми.

Обсуждение

Изучение уровня экспрессии мРНК гена адгезивной молекулы Р-селектина и образование лейкоцит-тромбоцитарных агрегатов представляет несомненный интерес в плане их возможного влияния на эффективность антитромбоцитарной терапии у пациентов с ИБС, в т. ч. после КШ.

Согласно нашим данным, при увеличении экспрессии мРНК гена SELP статистически значимо возрастает абсолютное количество агрегатов нейтрофил+тромбоцит и относительное количество агрегатов нейтрофил+тромбоцит CD62P после КШ. Возможно, это связано с применением искусственного кровообращения, которое может вызывать активацию тромбоцитов и системный воспалительный ответ. В одном из исследований, описывающих функциональную активность тромбоцитов у пациентов, подвергшихся КШ, установлено, что количество тромбоцит-тромбоцитарных и тромбоцит-моноцитарных агрегатов, а также уровень экспрессии Р-селектина тромбоцитами были выше в первые сутки и через 1 мес. после операции в сравнении с показателями до КШ, повышенное количество тромбоцит-моноцитарных агрегатов снижалось через 3 мес. после КШ. Из возможных причин развития данного феномена предполагается также развитие воспалительного ответа вследствие применения искусственного кровообращения и уменьшение активности воспаления спустя 3 мес. после оперативного вмешательства [6].

Хотя уровни мРНК не обязательно пропорциональны выработке функциональных белков, в нескольких исследованиях была показана корреляция между экспрессией мРНК Р-селектина и функциональным белком [7][8].

В настоящем исследовании выявлено, что при повышении уровня агрегационной активности тромбоцитов с арахидоновой кислотой после КШ статистически значимо повышается относительное количество агрегатов моноцит+тромбоцит. При повреждении эндотелия возникает активация тромбоцитов, в просвет сосуда активно поступают вещества, способствующие рекрутингу лейкоцитов и образованию между ними межклеточных связей [9]. Чаще всего тромбоциты образуют агрегаты с моноцитами и нейтрофилами [10][11]. Согласно литературным данным, тромбоцит-моноцитарные агрегаты могут быть более чувствительным маркером воспаления и активации тромбоцитов после КШ, чем уровень Р-селектина [6].

По результатам нашего исследования у резистентных к АСК пациентов до КШ выше уровни SELP, агрегатов тромбоцит+тромбоцит CD62P и моноцит+тромбоцит.

Как правило, более высокий уровень активированных тромбоцитов с экспрессированным на них P-селектином, большее количество тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов и повышенный уровень растворимого P-селектина в периферической крови чаще регистрируется у пациентов с воспалительными и тромботическими расстройствами [12]. Song C, et al. обнаружили высокую экспрессию Р-селектина при ИБС, а также связь между тяжестью ИБС и уровнем Р-селектина [13], а в другом исследовании у здоровых пожилых лиц уровень экспрессии Р-селектина представлен в качестве маркера неблагоприятных сердечно-сосудистых событий [14]. Но в то же время в российском исследовании не было установлено статистически значимого увеличения Р-селектина при ИБС [15].

Нами также составлена прогностическая модель развития резистентности. При включении клинико-лабораторных предикторов, уровня экспрессии SELP, количества межклеточных агрегатов в модель, статистическую значимость продемонстрировал лишь уровень экспрессии SELP. Причем его вклад в развитие резистентности составляет 12,5%.

Изучение экспрессии SELP, количества межклеточных агрегатов может помочь в прогнозировании развития резистентности к АСК и как следствие послеоперационных осложнений после КШ. Будущие исследования должны дать валидизацию оценки лейкоцит-тромбоцитарных комплексов, экспрессии SELP и перспективу внедрения результатов в кардиологическую практику.

Ограничения исследования. Небольшой объем выборки. Дальнейшие исследования необходимы для уточнения предикторов недостаточного ответа тромбоцитов на АСК с целью персонификации антитромбоцитарной терапии у пациентов после КШ.

Заключение

С увеличением экспрессии SELP статистически значимо возрастает абсолютное количество агрегатов нейтрофил+тромбоцит и относительное количество агрегатов нейтрофил+тромбоцит CD62P после КШ. При повышении уровня агрегационной активности тромбоцитов с арахидоновой кислотой после КШ статистически значимо повышается относительное количество агрегатов моноцит+тромбоцит. Более высокий уровень SELP, абсолютного количества агрегатов моноцит+тромбоцит, а также относительного содержания агрегатов тромбоцит+тромбоцит CD62P ассоциированы с резистентностью к АСК. Уровень экспрессии SELP является предиктором развития резистентности к АСК.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.