Нейтрофильные внеклеточные ловушки — перспективный маркер неблагоприятного прогноза у оперированных пациентов с инфекционным эндокардитом

Достигнутые успехи современных диагностических и лечебных подходов ведения пациентов с инфекционным эндокардитом (ИЭ) не приводят к достаточному снижению заболеваемости и летальности, наоборот, наблюдаются опасные тенденции к их росту, а прогноз болезни остается неблагоприятным. Остро необходимым представляется поиск ранних предикторов осложненного течения ИЭ на любом этапе болезни, в т. ч. после хирургического лечения. Существующие маркеры оценки риска неблагоприятных событий при ИЭ применяются редко и не обладают оптимальной прогностической ценностью [1]. Основываясь на современной концепции патогенеза ИЭ — иммунотромбозе, обсуждается роль нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) как возможного раннего и патогенетически обоснованного маркера прогрессирования инфекции, в особенности, эмболических событий и госпитальной летальности [2][3]. Впервые нетоз как компонент врожденного иммунитета, отличный от фагоцитоза и дегрануляции, и основанный на формировании НВЛ в ответ на инфекцию, описал Brinkmann V, et al. в 2004г [3]. Стимуляция нейтрофилов патогенами и в большей степени медиаторами воспаления вызывает высвобождение из них хроматиновых волокон с антимикробными компонентами, такими как эластаза, катепсин G и миелопероксидаза с формированием НВЛ. Роль НВЛ заключается в захвате и уничтожении патогенных микроорганизмов [3]. Однако избыточная продукция НВЛ, по всей видимости, приводит к повреждению клеток, прогрессированию воспаления и тромбообразованию [4][5]. В патогенезе ИЭ предполагается развитие неконтролируемого процесса нетоза. Однако роль НВЛ у пациентов с ИЭ не изучена, в частности, после кардиохирургических вмешательств. Таким образом, целью данного исследования являлось определение прогностической значимости формирования НВЛ у оперированных пациентов с ИЭ.

Материал и методы

Проспективное когортное исследование выполнено у пациентов старше 18 лет, подписавших информированное согласие на сбор обезличенных медицинских данных. Включено 46 оперированных пациентов с достоверным диагнозом ИЭ по критериям Дюка 2015 [1][6], госпитализированных в кардиохирургический стационар (г. Москва) в 2021-2022гг, и 50 пациентов, оперированных по поводу клапанных пороков сердца, исключая ИЭ, в качестве группы контроля. Не включали пациентов с неактивным ИЭ, небактериальным тромбоэндокардитом, активными онкологическими заболеваниями и получающих иммуносупрессивную терапию. Группы были сопоставимы по полу и возрасту. Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice), принципами Хельсинкской декларации и одобрено локальным этическим комитетом Медицинского института Российского университета дружбы народов имени Патриса Лумумбы (протокол № 27 от 18.03.2021).

Всем пациентам выполняли традиционные лабораторно-инструментальные обследования, в т. ч. оценку маркеров воспаления и эхокардиографическое исследование сердца. Исследование уровня НВЛ проводили в мазках крови от каждого пациента основной группы и группы контроля при поступлении и на 7 сут. после кардиохирургической операции. Временной интервал в 7 дней был выбран эмпирически, как усредненный показатель для оценки динамики лабораторных показателей на фоне проводимого лечения. Из пробирки с ЭДТА брали 2 мл крови для изготовления стерильных мазков на предметных стеклах по типу "монослой" с дальнейшей фиксацией в красителе-фиксаторе эозине метиленовом синем по Май-Грюнвальду ("ООО Минимед", Россия) (3,5 мин) и окраской в красителе Азур-Эозин по Романовскому-Гимзе ("ООО Минимед", Россия) (20-25 мин) ¹. Микроскопию окрашенных мазков проводили с помощью системы автоматической микроскопии МЕКОС-Ц2 (ООО "Медицинские компьютерные системы (МЕКОС)", Россия)1. Далее выполнялся подсчет количества нативных неразрушенных фагоцитов (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов) и уровня НВЛ по формуле: НВЛ, % = N_НВЛ / (N нативные нейтрофилы + N эозинофилы + N базофилы) × 100%.

Исходы исследовались за период лечения в кардиохирургическом стационаре. Оценивалась первичная комбинированная конечная точка (ПККТ) и отдельные ее компоненты: госпитальная летальность от всех причин, эмболические события, внутрисердечные (абсцесс, фистула/перфорация клапана, отрыв хорд, увеличение регургитации/вегетаций, дисфункция протеза) и инфекционные (сепсис) осложнения.

Статистический анализ проведен в программе IBM SPSS Statistics, Version 27. Количественные переменные описывали как медиана (Me) и интерквантильный размах (IQR). Качественные переменные описывали абсолютными (n) и относительными (%) значениями. Также оценивалась отрицательная (ОПЦ) и положительная прогностическая ценность (ППЦ). Пороговые значения для количественных предикторов устанавливались на основе ROC-анализа при оптимальном соотношении чувствительности и специфичности с определением площади под кривой (AUC). Связь между определенным исходом и фактором риска оценивали с помощью отношения шансов (ОШ) с определением 95% доверительного интервала (ДИ). Вероятность выживания оценивали методом построения кривых выживаемости Каплана-Мейера, сравнение производили с помощью логрангового критерия. Во всех видах анализа статистически значимым считалось значение p<0,05.

Результаты

Оперированные пациенты с ИЭ были преимущественно представлены лицами мужского пола среднего возраста с частым поражением трикуспидального и аортального клапанов (табл. 1). У половины пациентов имелись сердечно-сосудистые заболевания, часто встречался вирусный гепатит С, хроническая болезнь почек и сахарный диабет. Первичный ИЭ отмечался у 37,0% (n=17) пациентов. В структуре вторичного ИЭ преобладали дегенеративные пороки сердца, так же как и у оперированных пациентов с пороками сердца без ИЭ.

Внутрисердечные осложнения при поступлении имелись у 84,8% (n=39) пациентов с ИЭ, представленные отрывом хорд (23,9%, n=11), абсцессами клапанов (23,9%, n=11), перфорацией створок (21,7%, n=10), параклапанными фистулами (8,7%, n=6) и дисфункцией протеза (6,5%, n=3). Сочетанные повреждения клапанного аппарата имелись у 2 пациентов. Эмболические события до операции наблюдались у 23,9% (n=11) пациентов, после операции эмболических событий не было ни у одного наблюдавшегося.

Дооперационная антибактериальная терапия проводилась всем пациентам с ИЭ (медиана составила 27,5 [ 17,3-38,8] дней), из них в большинстве случаев были назначены схемы, включающие гликопептиды в 82,6% (n=38) случаев, несколько реже — цефалоспорины 50,0% (n=23), аминогликозиды 28,3% (n=13) и карбапенемы 21,7% (n=10). После операции антибактериальная терапия продолжалась в среднем 2-6 нед.

Осложненное течение раннего послеоперационного периода имелось у 76,1% (n=35) пациентов с ИЭ, наиболее часто отмечалось острое повреждение почек у 54,3% (n=25) и постперикардиотомный синдром у 28,3% (n=13) пациентов. Госпитальная летальность среди оперированных пациентов с ИЭ составила 10,9% (n=5).

Этиологическая принадлежность ИЭ установлена у 84,9% пациентов, преимущественно представленная стафилококками (41,3%), с преобладанием Staphylococcus aureus (34,8%), энтерококками (10,9%) и стрептококками (10,9%). Сочетание возбудителей Enterococcus faecalis + S. aureus выявлено у 10,9% пациентов. Другие возбудители определены у 4,4% обследованных, представленные Pseudomonas aeruginosa (2,2%) и Granulicatella adiacence (2,2%). У 3 (6,5%) пациентов выявлен ИЭ, вызванный Bartonella quintana. Исследование уровня НВЛ в зависимости от этиопатогенетического агента не выявило значимых различий.

Внутригрупповых отличий по уровню НВЛ при поступлении и в динамике не было выявлено как в основной группе пациентов с ИЭ, так и в группе контроля (оперированные пациенты с пороками сердца без ИЭ). При этом уровни НВЛ при поступлении достоверно не отличались между пациентами с ИЭ и без ИЭ, что, вероятно, объясняется длительным дооперационным периодом антибактериальной терапии в основной группе, повлиявшей на активность воспаления (рис. 1, табл. 2). Однако обращала внимание достоверная разница между уровнем НВЛ на 7 день после операции в группе с ИЭ и группе контроля, что, вероятно, связано с наличием бактериального воспаления и одновременно свидетельствует об отсутствии вклада хирургического лечения в повышение НВЛ, сопровождающегося лишь асептическим воспалением.

События из ПККТ наблюдались у 76,1% (n=35) оперированных пациентов с ИЭ и ассоциировались с повышением уровня НВЛ через 7 дней после операции, по сравнению с оперированными пациентами с пороками сердца без ИЭ (табл. 3). В группе контроля за период наблюдения события из ПККТ не было.

При анализе отдельных компонентов ПККТ отмечались более высокие уровни НВЛ у пациентов с ИЭ в отношении госпитальной летальности как при поступлении, так и в динамике, по сравнению с выжившими пациентами с ИЭ и оперированными пациентами с пороками сердца без ИЭ (табл. 4).

Методом ROC-анализа вычислено пороговое значение НВЛ в динамике для прогнозирования госпитальной летальности, составившее 11,2%, характеризующееся чувствительностью 80,0%, специфичностью 90,0%, ППЦ 66,7%, ОПЦ 100,0%, AUC 0,915, р=0,003 (рис. 2).

При проведении многофакторного регрессионного анализа выявлено, что уровень НВЛ выше найденного отрезного значения повышал вероятность госпитальной летальности у оперированных пациентов с ИЭ (ОШ 23,9; 95% ДИ: 1,7-344,8, p=0,02) (табл. 5).

Наличие внутрисердечных осложнений при поступлении также ассоциировалось с достоверно более высокими исходными уровнями НВЛ по сравнению с пациентами без аналогичных изменений (табл. 6).

Сепсис в послеоперационном периоде у пациентов с ИЭ диагностирован у 8,7% (n=4) пациентов и также ассоциировался с повышением уровня НВЛ в динамике (табл. 7).

Методом ROC-анализа вычислено пороговое значение НВЛ в динамике для прогнозирования послеоперационного сепсиса, также составившее 11,2%, характеризующееся чувствительностью 75,0%, специфичностью 88,0%, ППЦ 60,0%, ОПЦ 100,0%, AUC 0,884, р=0,01 (рис. 3). Найденное отрезное значение НВЛ в динамике в 22 раза увеличивало вероятность развития сепсиса у оперированных пациентов с ИЭ (ОШ 22,0 (95% ДИ: 1,9-256,8, p=0,01)).

Интерес представляет клиническое наблюдение пациентки с длительным анамнезом внутривенной наркомании и ИЭ трикуспидального клапана, вызванным S. aureus, у которой развился ранний протезный ИЭ, сопровождавшийся 19-кратным увеличением НВЛ в динамике (1,3%→24,6%).

Таким образом, исходно высокие уровни НВЛ могут свидетельствовать о тяжелом инфекционном поражении клапанного аппарата сердца, однако увеличение этого показателя в динамике также ассоциировано с развитием осложнений в послеоперационном периоде у пациентов с ИЭ (сепсис, ранний протезный ИЭ), что свидетельствует о важности определения уровня НВЛ в динамике.

Мы также проанализировали связь уровня НВЛ с развитием эмболических событий, однако в нашей когорте пациентов данной закономерности обнаружено не было, что, вероятно, было обусловлено давностью эмболических событий в предшествующие госпитализации и отсутствием их в послеоперационном периоде (табл. 8).

При многофакторном регрессионном анализе предикторами эмболических осложнений являлись традиционные показатели: правосторонний ИЭ (ОШ 34,09 (95% ДИ: 3,99-291,16), р<0,0001), внутривенная наркомания (ОШ 10,46 (95% ДИ: 2,50-43,81), р<0,001), вирусный гепатит С (ОШ 7,50 (95% ДИ: 2,00-28,05), р<0,002) и увеличение размера вегетаций (ОШ 3,89 (95% ДИ: 1,18-12,84), р<0,02).

При анализе выживаемости также отмечались худшие показатели у оперированных пациентов с ИЭ и НВЛ ≥11,2% в динамике через 7 дней после операции (рис. 4). Отметим, что расхождение кривых Каплана-Мейера отмечалось уже в раннем послеоперационном периоде.

Таким образом, повышение НВЛ в динамике ≥11,2% у оперированных пациентов с ИЭ ассоциировалось с осложненным течением раннего послеоперационного периода и худшей выживаемостью.

Обсуждение

Иммунотромбоз является новым патофизиологическим механизмом при инфекционных заболеваниях и представляет собой физиологический процесс активации эндотелиального, тромбоцитарного и плазменного звеньев гемостаза, приводящий к высвобождению НВЛ, служащих для захвата и уничтожения бактерий, попавших в кровоток [2][7]. В отечественной и зарубежной литературе имеются сведения о том, что образование НВЛ играет важную роль при разных аутоиммунных заболеваниях [8][9], а также при бактериальных, вирусных, грибковых инфекциях, в т. ч. при сепсисе [4][10][11].

Изучение НВЛ при ИЭ ограничивается только экспериментальными исследованиями. Анализ литературы свидетельствует как о позитивном, так и о негативном влиянии формирования НВЛ на патофизиологические процессы, происходящие в тканях и органах. Jung CJ, et al. (2015) продемонстрировали амбивалентную роль НВЛ на крысиной модели ИЭ (n=9, НВЛ в вегетациях), вызванного Streptococcus mutans: с одной стороны, на ранних стадиях заболевания НВЛ обладали защитным механизмом, сдерживающим инфекцию, с другой стороны — на поздних стадиях болезни происходило развитие неконтролируемого нетоза, приводящего к усилению коагуляции, способствующему росту вегетации, прогрессированию воспаления, повреждению клапанов и подклапанных структур [10]. Схожие результаты получены Hsu CC, et al. (2019) также на крысиной модели ИЭ (НВЛ в вегетациях), вызванного S. aureus, подтвердившие существенную роль НВЛ в росте вегетаций [12]. В этом же исследовании было выявлено, что введение ДНКазы I значительно уменьшало размер вегетаций. Таким образом, можно предположить, что активность инфекционного процесса негативно влияет на образование НВЛ, определяя развитие неконтролируемого нетоза.

Исследования НВЛ на пациентах с ИЭ отсутствуют, однако имеются данные, полученные от пациентов с инфекциями кровотока. Так, Li RHL, et al. (2018) у пациентов с сепсисом продемонстрировали негативную роль НВЛ в прогнозировании госпитальной летальности, ассоциированной с развитием диссеминированного внутрисосудистого свертывания и полиорганной дисфункции [4]. В наше исследование были включены пациенты с осложненным ИЭ, потребовавшим кардиохирургического лечения. Среди обследованных с ИЭ мы наблюдали более высокий уровень НВЛ, особенно в динамике, отличающийся от показателей у оперированных пациентов с пороками сердца без ИЭ, что, вероятно, свидетельствует о развитии неконтролируемого нетоза при ИЭ, приведшем к деструктивным процессам в сердце. Также у оперированных пациентов с ИЭ нами выявлена связь высокого уровня НВЛ с неблагоприятным прогнозом (госпитальной летальностью и инфекционными осложнениями). Отдельно отметим, что повышение уровня НВЛ не имело связи с самим фактом хирургического вмешательства, т. к. мы не наблюдали прироста уровня НВЛ после кардиохирургических операций у пациентов группы контроля. Данный феномен позволяет предположить связь повышения НВЛ в группе пациентов с ИЭ именно в контексте наличия тяжелой бактериальной инфекции.

Исследования по определению пороговых уровней НВЛ для прогнозирования неблагоприятных событий единичны. В частности, у 73 пациентов с сепсисом различной этиологии было отмечено, что при уровне НВЛ ≥23,0% летальность наблюдалась в 100% случаев [13]. В другом исследовании, включившем 34 пациента с коронавирусной инфекцией, вызванной вирусом SARS-CoV-2, отмечено, что повышение НВЛ ≥16% служит критерием негативного прогноза заболевания и риска летального исхода [14]. В ходе нашего исследования определен отрезной уровень для прогнозирования госпитальной летальности у оперированных пациентов с ИЭ, составивший 11,2%, при котором вероятность смерти в стационаре увеличивалась в 24 раза. Более низкие пороговые уровни НВЛ, полученные нами, вероятно, объясняются особенностью изучаемой популяции — одновременное сочетание осложненного течения ИЭ с предшествующей длительной антибактериальной терапией (медиана дооперационного антибактериального лечения — 27,5 дней), уменьшающей активность воспаления, но не позволяющей добиться полного контроля над инфекцией.

Более того, нам удалось определить отрезной уровень для прогнозирования септических осложнений в послеоперационном периоде у пациентов с ИЭ, также составивший 11,2%, при котором в 22 раза увеличивалась вероятность развития сепсиса у оперированных пациентов. Аналогичных данных в научной литературе мы не нашли. Тем не менее наши результаты согласуются с ранее проведенными исследованиями у пациентов с сепсисом любой этиологии, свидетельствующими о высоком уровне НВЛ при инфекциях кровотока [4][13].

Отсутствие ассоциаций этиологической принадлежности ИЭ и уровня циркулирующих НВЛ в крови в нашем исследовании могло быть связано с несколькими причинами. Во-первых, некоторые микроорганизмы, в частности, S. aureus, способны вырабатывать различные факторы вирулентности, препятствующие образованию или способствующие разрушению НВЛ, ограничивая их количество и защитную активность, реализуя механизмы ускользания бактерии от системы врожденного иммунитета для выживания в среде хозяина [7]. Во-вторых, вовлеченность большого количества НВЛ в состав вегетации могла нивелировать их уровень в циркулирующей крови. В-третьих, недостаточное количество пациентов с установленной этиологией ИЭ, а также трудности определения истинной этиологической принадлежности ИЭ могли внести вклад в получение неопределённых результатов. Для подтверждения этих гипотез необходимо проведение дальнейших исследований на большей популяции пациентов с ИЭ с определением уровня НВЛ в разных видах биологического материала (цельная кровь, ткани резецированных клапанов, вегетации).

Связь маркеров воспаления и НВЛ имеет разнонаправленные ассоциации. Так, Zhang F, et al. (2017) у 23 пациентов с сепсисом не получили корреляционных связей НВЛ с параметрами воспаления [15], в отличие от Zuo Y, et al. (2020), продемонстрировавших четкие взаимосвязи маркеров воспаления и НВЛ у 50 пациентов с COVID-19 [16]. В нашем исследовании не выявлено ассоциаций между лейкоцитами, скоростью оседания эритроцитов, С-реактивным белком и НВЛ, что может быть связано с низкой активностью воспаления на фоне предшествующей антибактериальной терапии.

В единичных экспериментальных исследованиях на крысиной модели ИЭ была выявлена связь НВЛ с увеличением размеров вегетаций и эмболическими событиями [10][12]. Учитывая особенности патогенеза ИЭ, основанные на иммунотромбозе, мы также предполагали наличие связи НВЛ с эмболиями. Однако в нашей когорте пациентов данная гипотеза не нашла подтверждения, что могло быть связано с некоторыми ограничениями исследования. Так как уровень НВЛ динамичен, наиболее информативно его изучение в непосредственной близости от наблюдаемого события. Мы имели возможность исследовать уровень НВЛ при поступлении в стационар, когда эмболические события были отдаленно свершившимися, а в послеоперационном периоде мы не наблюдали ни одного события. Вышесказанное определяет необходимость проведения дальнейших исследований на широкой популяции пациентов с ИЭ.

Таким образом, НВЛ являются новыми перспективными маркерами оценки прогноза у пациентов с ИЭ, в т. ч. оперированных. Значения НВЛ ≥11,2% с высокой точностью предсказывают наступление летального исхода в стационаре и развитие послеоперационного сепсиса, а также неконтролируемое течение инфекционного процесса с развитием внутрисердечных и инфекционных осложнений. Для расширения прогностического потенциала НВЛ, в первую очередь направленного на своевременную оценку риска эмболических событий, актуально продолжение исследований на более крупных популяциях пациентов с ИЭ.

Ограничения исследования. ИЭ относится к непредсказуемым заболеваниям, что определяет необходимость постоянного поиска новых возможностей оценки прогноза и определения неблагоприятного течения заболевания. Исследуемая нами группа пациентов, госпитализированных в кардиохирургический стационар по причине невозможности контроля над течением ИЭ и имеющая длительный этап консервативного лечения, неизбежно имела ограничения для изучения, такие как низкая частота развития анализируемых событий из конечных точек и длительные временные промежутки между возникновением неблагоприятного события и взятием крови на исследование.

Также следует отметить отсутствие стандартизированной методики определения НВЛ [17][18]. НВЛ могут быть идентифицированы как различными методами (гистохимические исследования с последующей световой микроскопией, проточная цитофлуориметрия, иммунофлуоресцентная микроскопия, различные другие виды микроскопии — конфокальная, сканирующая и трансмиссионная электронная, а также другие), так и в различных формах — от изучения компонентов НВЛ (внеклеточная ДНК, нейтрофильная эластаза 2, миелопероксидаза и катепсин G, гистоны H1, H2A, H2B, H3 и H4 и другие) до определения целых клеток. В зарубежных исследованиях преимущественно представлено изучение компонентов НВЛ без их количественной оценки. Мы применили простой в исполнении метод, разработанный в России, по изучению цельно клеточного состава клеток крови с обнаружением НВЛ в мазках при автоматической микроскопии¹, позволивший нам провести количественный подсчет форменных элементов для выведения пороговых значений. Однако, безусловно, это несколько ограничило прямое сравнение полученных результатов с рядом ранее проведенных немногочисленных исследований.

Заключение

НВЛ в крови у оперированных пациентов c ИЭ являются новыми перспективными маркерами прогнозирования осложненного течения заболевания. Значения НВЛ ≥11,2% у оперированных пациентов с ИЭ в 24 раза увеличивают вероятность госпитальной летальности и в 22 раза — развитие послеоперационного сепсиса.

Отношения и деятельность. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 22-75-10012) с использованием человеческого биоматериала, собранного и сохраняемого в рамках научной программы. Оборудование для сбора, хранения и транспортировки биоматериала человека, оборудование для обследования пациентов приобретено за счет средств Программы стратегического академического лидерства РУДН, Приоритет 2030.