Количество нейтрофильных гранулоцитов крови ассоциировано с диффузным поражением коронарных артерий у больных с повышенной концентрацией липопротеида (а)

Одной из наиболее тяжелых форм поражения коронарных артерий является диффузный атеросклероз, для которого характерно преобладание осложненных атеросклеротических поражений с кальцинированными и фиброзными бляшками [1][2]. Диффузное поражение коронарного русла, захватывающее его дистальные сегменты, считается независимым фактором риска (ФР) сердечно-сосудистых осложнений и смертности у пациентов, перенесших операцию аортокоронарного шунтирования (АКШ) [1]. С развитием эффективной медикаментозной терапии и возможностей эндоваскулярных методов лечения доля больных с диффузным стенозированием коронарных артерий, требующих реваскуляризации миокарда, увеличивается.

В развитие атеросклероза основной вклад вносят дислипидемия и воспаление. Моноциты считаются основной популяцией иммунных клеток, задействованных в атерогенезе. При воспалении моноциты мигрируют в субэндотелиальное пространство с последующей дифференцировкой в макрофаги, которые продуцируют широкий спектр биологически активных молекул, способствуя ремоделированию сосудистой стенки. Результаты опубликованных исследований подтверждают взаимосвязь между типом поражения коронарных артерий и изменениями субпопуляционного состава моноцитов периферической крови [3].

Нейтрофилы также вовлечены во все этапы атерогенеза, начиная с ранних стадий и заканчивая развитием комплексных осложнений. Данные двух крупных системных обзоров и метаанализов показали, что увеличение нейтрофил-лимфоцитарного соотношения, свидетельствующее о наличии системного воспаления, ассоциировалось с повышенным риском сердечно-сосудистой смертности у пациентов, перенесших хирургическое вмешательство на сердце и сосудах [4][5].

Среди липидных факторов, задействованных в атерогенезе, следует выделить липопротеид (а) (Лп(а)). Повышенный уровень Лп(а) в крови является доказанным и независимым ФР ранней манифестации атеросклероза различных сосудистых бассейнов и ассоциированных с ним сердечнососудистых осложнений в молодом и среднем возрасте [6]. Лп(а) локализуется в богатых макрофагами участках атеросклеротических бляшек человека [7]. Предполагается, что он может активировать клетки неспецифического иммунитета [7], однако до конца механизм его атерогенного действия пока не изучен.

В настоящей работе мы оценили уровень Лп(а) и других параметров липидного спектра, состав лейкоцитов крови у больных с очаговым и диффузным поражением коронарных артерий, перенесших операцию АКШ, изучили влияние Лп(а) на активацию нейтрофильных гранулоцитов в цельной крови и в первичной культуре клеток.

Материал и методы

В одномоментное одноцентровое исследование были включены 120 пациентов мужского пола, средний возраст 67±5 лет, с клинической картиной стабильной стенокардии II-IV функционального класса, многососудистым поражением коронарных артерий, госпитализированные в НМИЦК им. Е.И. Чазова для выполнения плановой операции АКШ в 2018-2019гг. В исследование не включали пациентов с инфарктом миокарда, острым нарушением мозгового кровообращения, хирургическими или эндоваскулярными вмешательствами в предшествующие 3 мес., злокачественными новообразованиями, тяжелой почечной или печеночной недостаточностью, с воспалительными/инфекционными заболеваниями, сахарным диабетом 2 типа, а также пациентов, принимавших иммунотропные препараты или препараты, потенциально способные повлиять на уровень Лп(а) (аферез, никотиновая кислота, ингибиторы PCSK9, глюкокортикоиды, половые гормоны). На момент включения в исследование все пациенты получали рекомендованную для больных атеросклерозом терапию: бета-блокаторы, аспирин/клопидогрел, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента/сартаны, статины.

Исследование было выполнено в  соответствии с  принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом ФГБУ "НМИЦК им. акад. Е.И. Чазова" Минздрава России (протокол № 231 от 27.11.2017). Все включенные пациенты дали письменное согласие на участие в исследовании.

Анализ предоперационной коронароангиографии проводился независимо двумя интервенционными кардиологами; анализ интраоперационных данных проводил сердечно-сосудистый хирург. Тип коронарного поражения (диффузный или очаговый) был определен на основании предоперационной коронароангиографии и  протоколов операций. Критерием для включения пациента в группу с диффузным атеросклерозом было распространенное до дистальных сегментов поражение с  диаметром сосуда <2  мм на протяжении >75% дистальнее значимого стеноза в ≥2 целевых для шунтирования коронарных артериях [8]. Кроме этого, в группу диффузного поражения были отнесены пациенты с диаметром шунтированных артерий в месте анастомоза <1,5 мм, что оценивалось интраоперационно.

Всем пациентам был выполнен общий анализ крови с  определением лейкоцитарной формулы с  использованием анализатора крови Sysmex CA50 (Япония). Забор образцов крови выполнялся перед проведением операции АКШ.  Концентрацию общего холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеидов высокой плотности (ЛВП) определяли в  сыворотке ферментативным колориметрическим методом на анализаторе Architect C-8000 (Abbott, США). Уровень ХС липопротеидов низкой плотности (ЛНП) рассчитывали по формуле: Фридвальда с  модификацией Далена: ХС ЛНПкорр = ОХС—ХС ЛВП — ТГ/2,2 — 0,3 × Лп(а)/38,7, где ХС ЛНПкорр — уровень ХС ЛНП, корригированный по уровню Лп(а).

Концентрацию Лп(а) в  сыворотке крови измеряли при помощи разработанного в лаборатории иммуноферментного анализа с использованием моноспецифических поликлональных антител барана против Лп(а) человека [9]. Концентрацию С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке определяли высокочувствительным иммуноферментным методом при помощи набора "СРБ-ИФАБЕСТ высокочувствительный" (Вектор БЕСТ, Россия).

Изучение активации нейтрофильных гранулоцитов в  присутствии Лп(а) в  цельной крови и  в  первичной культуре клеток Препараты Лп(а) получали из плазмы крови методом ступенчатого ультрацентрифугирования в градиенте плотности нейтральной соли NaBr или аффинной хроматографии на сорбенте, содержащем в качестве лиганда высокоспецифичные антитела барана против Лп(а) человека [10].

Препараты Лп(а) вносили в образцы цитратной крови здоровых добровольцев и инкубировали 2 ч при 37⁰ С.Клетки окрашивали антителами к CD16 и CD66b (eBioscience, США). Лизис эритроцитов и фиксацию клеток проводили с использованием коммерческих наборов (BD Biosciences, США). Связывание антител оценивали методом цитофлуориметрии в потоке на приборе FACS Calibur (BD Immunocytometry Systems).

Для получения нейтрофильных гранулоцитов образцы крови доноров в цитратном антикоагулянте наслаивали на двойной градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина (ПанЭко, Россия) в соответствии с протоколом¹. После центрифугирования отбирали нижнее кольцо нейтрофильных гранулоцитов, клетки отмывали стерильным физиологическим раствором и ресуспендировали в среде X-vivo (Lonza, США) с добавлением 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, по 50 Ед/мл пенициллина и стрептомицина, смеси неэссенциальных аминокислот (Thermo Fisher Scientific, США) и 1% аутологичной сыворотки и высаживали в 24-луночный планшет, предварительно покрытый полилизином (Sigma-Aldrich, Германия).

В культуру клеток вносили препараты Лп(а); в контрольные образцы (позитивный контроль) вносили 50 нМ форболмиристатацетата (Sigma-Aldrich, Германия). Формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) наблюдали в течение 3 ч при 37⁰ С в атмосфере 5% СО2. Клетки фиксировали формалином при комнатной температуре и окрашивали ДНК-красителем DAPI (Thermo Fisher Scientific, США). Образцы анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии (LEICA CTR5000, Nikon TI-2).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ MedCalc 20.104. Данные представлены как медиана (25-й процентиль; 75-й процентиль) в связи с ненормальном распределением. Межгрупповые различия оценивали с помощью критерия U МаннаУитни. По качественным признакам группы сопоставляли с помощью критерия Фишера. Для оценки связи изучаемых параметров с наличием диффузного поражения коронарных артерий рассчитывали отношение шансов с 95% доверительным интервалом (ДИ). Пороговые значения количества нейтрофилов для предсказания наличия диффузного поражения коронарных артерий, определение их чувствительности и специфичности получены при построении кривых операционных характеристик (ROC-анализ). Многофакторный анализ выполняли методом логистической регрессии, в модель вводили ФР, продемонстрировавшие связь с диффузным поражением коронарных артерий при однофакторном анализе. При создании модели также учитывалось отсутствие внутренних корреляционных связей между оцениваемыми параметрами. Различия считались статически значимыми при р<0,05.

Финансирование. В рамках гранта РНФ № 22-25- 00051 были выполнены следующие эксперименты: изучение активации нейтрофилов в цельной крови, изучение образования НВЛ в культуре клеток, выделенных из крови доноров.

Результаты

Согласно диффузному и локальному типу поражения коронарных артерий пациенты были разделены на две группы. Клинико-лабораторная характеристика групп представлена в таблице 1. При оценке показателей липидного спектра мы не обнаружили значимых различий среди больных, имеющих диффузное поражение коронарных артерий, в сравнении с пациентами с очаговым поражением коронарных артерий. Отмечалась тенденция к  более высокому уровню Лп(а) у  пациентов с  диффузным стенозированием коронарных артерий. В данной группе пациентов нами отмечено увеличение абсолютного количества лейкоцитов за счет нейтрофильных гранулоцитов. Достоверных различий в  содержании других клеток (моноциты, лимфоциты, эозинофилы, базофилы) не выявлено. Концентрация СРБ также была сопоставима в обеих группах.

По данным ROC-анализа, абсолютное количество нейтрофилов >2,9 млн/мл с чувствительностью 85% и специфичностью 42% ассоциировалось с диффузным поражением коронарных артерий (AUC 0,69 (95% ДИ: 0,60-0,77), р=0,0002). В  группе пациентов с  уровнем Лп(а) <30  мг/дл количество нейтрофилов >2,9  млн/мл с  чувствительностью 81% и  специфичностью 37% ассоциировалось с диффузным поражением коронарных артерий (AUC 0,64 (95% ДИ: 0,51-0,75), р=0,05). При этом в группе пациентов с уровнем Лп(а) ≥30 мг/дл диагностическая значимость количества нейтрофилов >2,9 млн/мл в отношении диффузного стенозирования коронарного русла была выше (AUC 0,74 (95% ДИ: 0,60-0,86), р=0,005, чувствительность 90%, специфичность 48%).

Для выявления параметров, оказывающих влияние на развитие диффузного поражения коронарного русла, выполнялся однофакторный логистический регрессионный анализ. Увеличение количества нейтрофилов ассоциировалось с развитием диффузного атеросклероза коронарных артерий (рис. 1). Вклад уровня Лп(а) был менее значимым и статистически недостоверным (рис. 1, табл. 2).

По данным многофакторного логистического анализа с введением в модель количества нейтрофилов и традиционных ФР (возраст, индекс массы тела, наличие артериальной гипертензии, курение) только количество нейтрофилов выше порогового уровня оставалось независимым фактором наличия диффузного стенозирования коронарного русла (табл. 2).

Исследование влияния Лп(а) на активацию нейтрофильных гранулоцитов в цельной крови и в культуре клеток

Препараты Лп(а) вносили в образцы донорской крови с цитратным антикоагулянтом; конечная концентрация Лп(а) составляла 10 мкг/мл. Внесение препаратов Лп(а) способствовало активации нейтрофилов, оцениваемой по увеличению мембранной экспозиции маркера нейтрофилов CD66b (рис. 2).

В первичной культуре нейтрофилов, выделенных из крови, в отсутствие стимуляторов морфология клеток не менялась, в то время как в присутствии форболмиристатацетата >70% клеток в течение 3 ч образовывали НВЛ (данные не приведены). При добавлении Лп(а) в конечной концентрации 10 мкг/мл мы также наблюдали формирование НВЛ, 50-70% клеток вступало в нетоз (рис. 3).

Таким образом, Лп(а) способен вызывать активацию нейтрофилов, детектируемую по увеличению экспозиции CD66b клетками в крови, а также образованию НВЛ в культуре.

Обсуждение

Основной и наиболее типичной формой коронарного атеросклероза является сегментарное поражение с вовлечением проксимальных и средних участков коронарных артерий. Диффузные формы, при которых захватываются дистальные участки артерий, ассоциируются с худшими результатами лечения ишемической болезни сердца (ИБС) и ограничивают проведение прямой реваскуляризации миокарда [1][2].

Повышенный уровень Лп(а) в крови является доказанным ФР развития атеросклероза в молодом возрасте, причиной преждевременной манифестации ИБС и развития сердечно-сосудистых осложнений [11].

Состояние постоянного низкоинтенсивного воспаления, которое выражается в увеличении концентрации "растворимых" маркеров воспаления и количества моноцитов и нейтрофилов, характерно для процесса старения и сопровождает развитие возрастассоциированных заболеваний [12][13]. Согласно клиническим данным, лейкоцитоз является независимым ФР ИБС, а также ассоциирован с низкой восприимчивостью к медикаментозной терапии у больных пожилого и старческого возраста [4]. В ряде исследований сообщалось, что повышенный уровень нейтрофилов при сердечно-сосудистых заболеваниях атеросклеротического генеза коррелирует с более высоким риском неблагоприятного исхода заболевания [14].

В настоящее время нейтрофилы рассматриваются как активные участники воспалительного процесса при атеросклерозе. Нейтрофилы и продукты их жизнедеятельности, в частности, НВЛ, обнаружены в атеросклеротических бляшках модельных животных и человека [15][16]. НВЛ образуются вследствие нетоза и состоят из волокон хроматина, а также ядерных, цитоплазматических и гранулярных белков нейтрофилов [17]. В инициации образования НВЛ в стенках артерии участвуют окисленные ЛНП и кристаллы ХС [17].

В настоящем исследовании мы сравнили содержание основных популяций лейкоцитов крови, уровень Лп(а) и другие показатели липидного спектра у перенесших операцию АКШ пациентов с очаговым и диффузным поражением коронарного русла. По концентрации СРБ как общепринятого маркера воспаления группы не различались. При оценке популяций лейкоцитов в зависимости от типа поражения коронарных артерий нами было выявлено более высокое количество нейтрофилов в подгруппе больных с диффузным поражением коронарных артерий относительно больных с очаговым поражением. Данные изменения могут свидетельствовать о более выраженном хроническом воспалении в сосудистой стенке у такой категории больных. При сравнении параметров липидного спектра отмечалась тенденция к более высокому уровню Лп(а) в подгруппе пациентов с диффузным стенозированием коронарных артерий. При анализе диагностической значимости количества нейтрофилов периферической крови в отношении диффузного типа коронарного стенозирования в подгруппе пациентов с гиперЛп(а) регистрировались более высокие значения площади под РОК-кривой. По сравнению с показателем количества нейтрофилов крови, повышенный уровень Лп(а), по данным регрессионного анализа, имел меньший вклад в развитие такого поражения коронарных артерий.

В экспериментах in vitro нами получены подтверждения того, что Лп(а) может активировать нейтрофилы. Внесение образцов Лп(а), полученных из крови пациентов с гиперхолестеринемией, приводило к увеличению экспозиции CD66b клетками в цельной крови и формированию НВЛ в условиях клеточной культуры. Таким образом, Лп(а) может реализовывать свою провоспалительную активность путем активации нейтрофилов.

Воспалительный потенциал Лп(а) может быть опосредован прямым действием входящих в его состав окисленных фосфолипидов на рецепторы клеток врожденного иммунитета, а также его способностью образовывать комплексы с провоспалительными молекулами [7]. Выявление механизмов реализации провоспалительной активности Лп(а) требует дальнейших исследований.

Ограничения исследования. Дизайн исследования не позволяет установить причинно-следственную связь изучаемых показателей с типом поражения коронарных артерий. Были включены пациенты старше 60 лет. Учитывая известные возраст-ассоциированные изменения иммунитета, для выявления связи между количеством и составом лейкоцитов с выраженностью поражения коронарного русла у пациентов более молодого возраста требуются дополнительные исследования.

Заключение

Нейтрофильные гранулоциты могут участвовать в формировании диффузных поражений коронарного русла у больных пожилого возраста. Одним из активаторов нейтрофилов может быть Лп(а). Сочетание высоких значений (выше порогового уровня) количества нейтрофилов и уровня Лп(а) повышает шансы развития диффузного атеросклероза коронарных артерий.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 22-25-00051 "Вклад нейтрофильных гранулоцитов в прогрессирование атеросклероза; участие атерогенных липопротеидов в активации клеток" (в рамках гранта выполнены следующие эксперименты: изучение активации в "цельной" крови, изучение образования нейтрофильных внеклеточных ловушек в культуре клеток, выделенных из крови доноров).