Взаимосвязь маркеров апоптоза с выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий и клинико-инструментальными характеристиками пациентов с ишемической болезнью сердца

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является основной причиной смерти от сердечно-сосудистых заболеваний [1]. В основе ее патогенеза лежит дисфункция как сосудистых, так и миокардиальных процессов, которые индуцируются и усугубляются ишемией, гипоксией, окислительным стрессом, воспалением и различными типами гибели клеток [1]. На сегодняшний день известны такие варианты клеточной смерти, как апоптоз, некроз, некроптоз, пироптоз, ферроптоз и аутофагия [1-3]. Поскольку миокард обладает крайне ограниченной способностью к регенерации, механизмы регулируемой гибели клеток, включая апоптоз, являются наиболее значимыми для современных исследований из-за их потенциальной обратимости. Более того, по данным ряда авторов, апоптоз считается одним из ключевых звеньев процессов атерогенеза [2][4-6]. Известно, что в результате воздействия перечисленных триггерных факторов, во всех клетках атеромы обнаруживаются морфологические признаки апоптоза, что впоследствии может приводить к нестабильности атеросклеротической бляшки с увеличением риска тромбообразования и разрыва [2].

Существует три классических сигнальных пути апоптоза: внешний (через рецепторы смерти), внутренний (митохондриальный) и путь напряжения эндоплазматического ретикулума. Активируя один или несколько из вышеперечисленных путей, различные стимулы могут индуцировать апоптоз [7].

Апоптоз, инициируемый внешним путем, запускается трансмембранными рецепторами смерти, которые являются членами семейства фактора некроза опухоли и содержат "домен смерти". Ряд лигандов и соответствующих рецепторов, включающих лиганд фрагмента, стимулирующего апоптоз FasL/FasR, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α)/рецептор фактора некроза опухоли (TNFR1), TRAIL, TRAIL/ DR4 и TRAIL/DR5 (DR от англ. death receptors — рецепторы клеточной смерти), могут способствовать передаче сигналов смерти с поверхности клетки на внутриклеточные пути через домен смерти [2].

Внутренний сигнальный путь (также известный как митохондриальный) индуцируется митохондриями и также может запускать апоптоз. Такие стимулы, как гипоксия, гипертермия и др., способствуют росту проницаемости внешней мембраны митохондрий и, таким образом, ускоряют высвобождение проапоптотических белков (цитохром С и фактор, индуцирующий апоптоз) из межмембранного пространства в цитозоль. Происходит активация фактора апоптотической протеазы 1 ((Apaf-1), клеточный цитозольный белок, инициирующий апоптоз), а также прокаспазы и впоследствии каспазы-9, которая, в свою очередь, стимулирует каспазу-3 и каспазу-7. Примечательно, что вышеупомянутые митохондриально-инициируемые события регулируют белки семейства В-клеточной лимфомы-2 (Bcl-2), которые находятся во внешней мембране митохондрий. Функционально они могут быть классифицированы на проапоптотические и антиапоптотические. К первым относятся Bad, Bax, Bak, Bid, Bim, PUMA (от англ. p53 upregulated modulator of apoptosis — проапоптотический белок из семейства Bcl-2, активирующийся при помощи транскрипционного фактора p53) и BNIP3 (от англ. BCL2 interacting protein 3 — белок семейства Bcl-2, участвующий в регуляции апоптоза); в то время как последние включают Bcl-2, Bcl-x, Bcl-XL и BAG. Среди белков семейства Bcl-2, Bax может усиливаться белком-супрессором опухоли p53 либо в ядре, либо в митохондриях (np53 или mp53); в то время как Bcl-2 или Bcl-ХL могут блокировать np53 или mp53-опосредованный апоптоз. Известно о существовании взаимодействия между внешними и внутренними путями, что подтверждается возможностью Fas-опосредованного апоптоза инициировать повреждение митохондрий посредством расщепления Bid каспазой-8 [2]. Одним из ведущих направлений по изучению процессов апоптоза при ИБС является исследование маркеров, индуцирующих апоптоз, а также его ингибирующих, их соотношения, в сыворотке либо плазме крови пациентов. В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение концентрации маркеров апоптоза у пациентов с различной выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий (КА), в т.ч. в рамках клинических особенностей течения ИБС.

Целью исследования явилось определение маркеров апоптоза в  сыворотке крови в  зависимости от выраженности атеросклеротического поражения КА, а  также изучение их связи с  клинико-инструментальными характеристиками пациентов с ИБС.

Материал и методы

Критерием включения больных было наличие ИБС, подтвержденное специфическими жалобами, данными анамнеза, ишемией при проведении электрокардиографического исследования либо холтеровского мониторирования электрокардиограммы, а  также присутствием коронарного атеросклероза при проведении коронарографии. Критериями невключения были: перенесенные <6 нед. назад инфаркт миокарда (ИМ) либо острое нарушение мозгового кровообращения, любое острое воспалительное заболевание, хроническая болезнь почек ≥III стадии (скорость клубочковой фильтрации <60 мл/ мин/1,73  м2), потребность в  гемодиализе или перитонеальном диализе, сахарный диабет обоих типов в  стадии декомпенсации (уровень гликированного гемоглобина >11% или уровень глюкозы в  течение суток ≥11,0  ммоль/л), гипертрофическая или дилатационная кардиомиопатия, онкологические заболевания, заболевания крови и  иммунной системы, беременность или период кормления.

В  исследование включены 176 человек (105 мужчин и  71 женщина), из них 150 — пациенты с  установленным диагнозом ИБС, 26 — здоровые добровольцы (группа контроля).

Больные были разделены на следующие группы: 1  группа — с  атеросклеротическим поражением КА без явных стенотических сужений (17 человек); 2 группа — с гемодинамически невыраженным (стенозы <50%) атеросклерозом КА (21 человек); 3 группа — с гемодинамически значимым (стенозы >50%) атеросклеротическим поражением КА (112 человек). Среди пациентов с ИБС были выделены подгруппы больных с  рестенозами после ранее перенесенной коронарной реваскуляризации миокарда в сроки от 4 мес. до 6 лет (25 человек), мультифокальным атеросклерозом (МФА) (35 человек), наличием ИМ в анамнезе (80 человек). Группа 4 была представлена здоровыми добровольцами, у которых сердечно-сосудистая патология исключалась на основании отсутствия клинических, анамнестических и  электрокардиографических признаков заболевания сердца (26 человек). Все группы были сопоставимы по возрасту и полу.

Проведенное исследование было одобрено этическим комитетом ФГАОУ ВО "КФУ им. В.И. Вернадского" (протокол № 5 от 19.05.2022). Пациенты дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Пациентам из 1, 2 и 3 групп была выполнена коронароангиография с использованием радиального или трансфеморального доступов в условиях рентгеноперационной на ангиографической установке "General Electric Optima IGS 330". Для объективной количественной оценки тяжести атеросклероза КА использована шкала SYNTAX в виде онлайн калькулятора (https://officialsyntaxscore.com).

Эхокардиографическое исследование (ЭхоКГ) проводили с помощью ультразвукового сканера "Samsung Accuvix A30" методом двухмерной ЭхоКГ, допплер-ЭхоКГ в импульсном режиме и режиме непрерывной волны, цветным допплеровским сканированием. Оценивали стандартные структурные параметры желудочков, сократительную и диастолическую функцию левого желудочка (ЛЖ), состоятельность клапанного аппарата.

МФА представляет собой гемодинамически значимое атеросклеротическое поражение нескольких магистральных сосудистых бассейнов, таких как брахиоцефальный и бассейн артерий нижних конечностей, а также наличие утолщения комплекса интима-медиа сонных артерий. Известно, что МФА зачастую определяет тяжесть состояния пациентов и дальнейший прогноз. В настоящем исследовании толщина комплекса интима-медиа (ТИМ), выраженность стеноза сонных артерий исследовались с помощью дуплексного ультразвукового сканирования внечерепных отделов брахиоцефальных артерий с помощью ультразвукового сканера "Samsung UGEO H60"; увеличением комплекса считали его значения, равные или превышающие 0,9 мм.

Также нами проведено исследование уровня маркеров апоптоза Bcl-2 (внутриклеточный белковый фактор — регулятор апоптоза, основной представитель семейства Bcl-2), Bax (белок-регулятор апоптоза, кодируемый геном BAX), Bcl-2/Bax, TRAIL (цитокин семейства факторов некроза опухоли, лиганд, вызывающий апоптоз, продукт гена TNFSF10) и p53 (продукт гена-супрессора опухоли TP53, транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл) в сыворотке крови. Для этого до проведения коронарографии проводился забор венозной крови натощак; кровь в вакуумной пробирке была выдержана при комнатной температуре 30 мин, после центрифугирования в течение 15 мин при 2500 об./мин сыворотку крови аликвотировали для дальнейшего замораживания (при -70 C). Использовали микропланшетный фотометр Multiskan FC Thermo Fisher Scientific (США), автоматический микропланшетный вошер W600 Sinnowa (Китай), термошейкер для планшетов PST-60HL Biosan (Латвия). Уровень Bcl-2 (нг/мл) определяли с помощью прямого иммуноферментного анализа с использованием аналитического набора "Human Bcl-2 ELISA Kit" (Cloud Clone Corp., Китай), Bax (нг/мл) — с использованием "Human ELISA Kit for Bcl2 associated X protein (Bax)" (Cloud Clone Corp., Китай), p53 (нг/мл) — "Human p53 ELISA Kit" (RayBiotech, Inc., США), TRAIL (пг мл) — "Human TRAIL ELISA Kit" (RayBiotech, Inc., США) согласно инструкциям производителя.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием программного обеспечения "Statistica 10.0". Для данных, выраженных в дихотомической шкале, в качестве описательных статистик использовали абсолютные и относительные частоты. Для данных, представленных в порядковой или количественной шкалах, в качестве описательных статистик использовали медиану (Me) и интерквартильный размах (Q25; Q75). Для оценки статистической значимости различий между двумя группами по каким-либо параметрам использовали критерий Манна-Уитни. Для оценки статистической связи между двумя признаками использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена с оценкой его значимости. Достоверными считали различия при р<0,05.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-20053, https://rscf.ru/project/22-25-20053/.

Результаты

Клинико-анамнестическая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в таблице 1.

В результате проведенного исследования отмечена сильная корреляционная связь очень высокой значимости между показателями Bcl-2 (r=-0,84; p<0,001), Bax (r=0,83; p<0,001), Bcl-2/Bax (r=-0,86; p<0,001), p53 (r=0,80; p<0,001), TRAIL (r=-0,78; p<0,001) и выраженностью атеросклеротического поражения КА (табл. 2).

Также выявлена корреляционная связь разной силы и значимости между показателями Bcl-2, Bax, Bcl-2/Bax, p53 и TRAIL — и рядом клинико-инструментальных характеристик пациентов с ИБС (табл. 3).

Необходимо отметить полученную достоверность различий (p<0,001) показателей Bcl-2, Bax, Bcl2/Bax, p53 и TRAIL между группами пациентов с МФА — и пациентами с поражением только КА, с рестенозами после ранее проведенной реваскуляризации — и с проходимыми стентами в КА, а также между группами пациентов с наличием ИМ и без острых коронарных событий в анамнезе (табл. 4).

Обсуждение

В 1972г австрийский патологоанатом Дж.Ф. Керр в сотрудничестве с шотландскими коллегами А.Х. Уайли и А.Р. Карри ввели понятие "апоптоз" (от древнегреческого ἀπόπτωσις — опадение листьев) для описания морфологически стереотипной формы клеточной гибели, характеризующейся уменьшением объема цитоплазмы, конденсацией хроматина и маргинализацией, сморщиванием ядра (кариопикноз), фрагментацией ядра (кариорексис), вздутием мембран и образованием отдельных апоптотических телец с неповрежденной клеточной мембраной [7].

Согласно современной биохимической классификации Номенклатурного комитета по клеточной смерти, апоптоз считается одним из морфологических признаков, характерных для различных типов регулируемой гибели клеток [8]. Важное значение в понимании процессов апоптоза при ИБС имеют проапоптотические и антиапоптотические белки семейства BCL-2. При этом соотношение Bcl-2/Bax является своего рода "реостатом", регулирующим гибель клеток в зависимости от баланса между Bcl-2 и Bax. Апоптоз кардиомиоцитов является известным ведущим процессом при развитии ишемии. При ингибировании апоптоза соотношение Bcl-2/Bax увеличивается, что способствует выживанию кардиомиоцитов в периинфарктной области. Предыдущие исследования выявили значительную роль аномальной экспрессии Bcl-2 в модуляции апоптоза кардиомиоцитов при реперфузионном повреждении [9][10].

Нами обнаружена обратная сильная очень высоко значимая корреляционная связь между концентрацией антиапоптотических маркеров Bcl-2 (r=- 0,84, p<0,001) и Bcl-2/Bax (r=-0,86, p<0,001), прямая сильная очень высоко значимая корреляционная связь между значениями проапоптотического показателя Bax (r=0,83, p<0,001) — и выраженностью атеросклеротического поражения КА, а также статистически значимые различия показателей в группах с МФА, рестенозами и ИМ в анамнезе (p<0,001) в сравнении с пациентами без указанных признаков. Схожие тенденции наблюдаются при рассмотрении значений ТИМ, баллов по шкале SYNTAX, функционального класса (ФК) стенокардии, ФК сердечной недостаточности (СН), фракции выброса (ФВ) ЛЖ и стадии артериальной гипертензии (АГ): нами выявлена корреляционная связь различной силы и значимости между уровнем Bcl-2, Bax, Bcl-2/Bax и указанными клинико-инструментальными показателями. Полученные данные свидетельствуют об активации процессов апоптоза, что, вероятно, может быть обусловлено действием провоспалительных цитокинов, гипоксии и явлений окислительного стресса у данных категорий пациентов.

Существует ряд исследований, подтверждающих роль апоптоза в развитии ремоделирования ЛЖ и СН после ИМ [2][10]. Более того, апоптоз коррелирует с прогрессированием параметров ремоделирования, что сопровождается увеличением Bax в месте инфаркта [10]. Экспериментальные исследования показали, что индуцированный ИМ апоптоз кардиомиоцитов связан с путем CHIP-p53 (от англ. carboxy-terminus of Hsc70 interacting protein — Hsp-ассоциированная Е3-убиквитин-лигаза); при подавлении р53 апоптоз миокарда и ремоделирование желудочков останавливаются [11].

Аномальный апоптоз сосудистых эндотелиальных клеток, макрофагов и гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов является распространенным патогенетическим этапом атерогенеза, в т.ч. способствующим нестабильности атеросклеротических бляшек. Так, апоптоз эндотелиальных клеток КА вызывает повреждения самого эндотелия, что лежит в основе развития атеросклероза. Апоптоз макрофагов опосредуется через путь CHOP-Bax (CHOP — транскрипционный фактор, гомологичный CCAAT-энхансер-связывающему белку) во время стресса эндоплазматического ретикулума, что приводит к разрыву атеросклеротической бляшки и, таким образом, повышает риск развития острого коронарного синдрома (ОКС). Наряду с гибелью макрофагов имеет место апоптоз ГМК сосудов, вероятно, индуцируемый макрофагами посредством взаимодействий лиганда смерти с соответствующими рецепторами смерти, что может быть центральным событием в разрыве бляшки. Апоптоз ГМК приводит к прогрессированию атерогенеза: способствует кальцификации, вызывает признаки медиальной дегенерации, включая атрофию, фрагментацию эластина [2][12].

Исследования in vitro продемонстрировали способность p53 дифференцированно регулировать пролиферацию и апоптоз макрофагов и ГМК [11][12]. Нами получены данные, демонстрирующие повышение концентрации p53 в сыворотке крови при увеличении выраженности атеросклеротического поражения КА (r=0,80; p<0,001), а также статистически значимо более высокие его значения в группах с МФА, рестенозами и ИМ в анамнезе (p<0,001) в сравнении с пациентами без указанных признаков. Обнаружена прямая умеренная корреляционная связь показателей р53 со значениями ТИМ (p<0,01), ФК стенокардии (p<0,001) и стадией АГ (p<0,001), слабая обратная корреляционная связь с ФВ ЛЖ (р<0,01), прямая очень слабая корреляционная связь с ФК СН (p<0,05). Выявленные закономерности подтверждают усиление апоптотических процессов у пациентов при прогрессировании атеросклероза и подчеркивают роль р53 как одного из маркеров неблагоприятного течения ИБС.

Важно подчеркнуть взаимосвязь воспалительных и апоптотических механизмов формирования и эволюции атеросклеротической бляшки, поскольку есть доказательства задержки, дефектного фагоцитоза и активного выделения провоспалительных медиаторов, сигнальных молекул при гиперлипидемии. По-видимому, при атеросклерозе имеет место "порочный круг", включающий в себя первичное воспаление, активацию проапоптотических сигнальных путей, чрезмерный апоптоз эндотелиальных клеток, макрофагов и ГМК, который, в свою очередь, сопровождается высвобождением провоспалительных цитокинов (интерлейкина-1, интерлейкина-1β), что в итоге приводит к прогрессированию воспаления, апоптоза и атеросклеротического повреждения [12]. В качестве доказательства от противного можно привести исследование, которое продемонстрировало ингибирующий апоптоз ГМК сосудов по пути JAK2- STAT3 (JAK — от англ. Janus Kinase — семейство ассоциированных с рецепторами киназ; STAT — от англ. Signal Transducer and Activator of Transcription — активатор транскрипции, участвующий в передаче сигнала) эффект противовоспалительного интерлейкина-10 [2].

Поскольку атеросклеротическая бляшка представлена гетерогенными популяциями клеток, стоит отметить, что их изменения не всегда носят однонаправленный характер. Индуцирует ли апоптоз воспаление, зависит от происхождения клеток: например, ГМК-подобные клетки, имеющие костномозговое происхождение, уже имеют провоспалительный фенотип, и их апоптоз уменьшает воспаление [13].

В связи с вышеописанным особенный интерес в качестве потенциальных мишеней терапевтического воздействия и диагностического поиска имеют некоторые сигнальные молекулы, которые принимают участие в регуляции процессов воспаления и апоптоза. Так, исследования предполагают, что TNF-α также имеет прогностическое значение у пациентов с острым ИМ. Однако клиническое исследование с применением антагониста TNF-α у данной категории больных не продемонстрировало положительного терапевтического эффекта. Эти результаты свидетельствуют о том, что значение TNF-α в развитии ИБС представляется сложным и включает в себя широкий спектр биологических процессов. Эта концепция подтверждается противоречивостью роли TRAIL в развитии атеросклероза и прогрессировании ИБС. После связывания с рецепторами TRAIL-R1 и TRAIL-R2, TRAIL инициирует внутриклеточный сигнальный каскад, приводящий к апоптотической гибели клеток. Однако точный молекулярный механизм действия TRAIL продолжает оставаться предметом научных дискуссий и инициации исследований. В ряде экспериментальных работ показана протекторная активность TRAIL. Так, у мышей с сахарным диабетом прямое введение TRAIL снижало развитие кардиомиопатии и имело антиатеросклеротическую активность. В нескольких клинических исследованиях сообщалось, что уровни TRAIL оказались обратно пропорциональны тяжести ИБС, ОКС и частоте сердечно-сосудистых осложнений после острого ИМ. По данным авторов, сывороточные уровни TRAIL были значительно снижены у пациентов с острым ИМ исходно (по сравнению с контрольной группой) и были связаны с увеличением частоты сердечной смерти и СН в течение 12 мес. наблюдения, даже после корректировки демографических и клинических параметров риска, а также оказались наиболее значимым и независимым предиктором комбинированной конечной точки смерти и госпитализации по поводу СН в течение 6 мес. после ОКС [1][2][14]. Низкие уровни TRAIL могут предсказывать худший прогноз также у пациентов с хронической СН и у пожилых пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями [1].

Это согласуется с полученными нами статистически значимо меньшими значениями концентрации TRAIL в сыворотке крови в группах пациентов с МФА, рестенозами и ИМ в анамнезе (p<0,001) в сравнении с пациентами без данных признаков, а также с обнаруженной обратной сильной очень высоко значимой корреляционной связью с выраженностью атеросклеротического поражения КА (r=-0,78; p<0,001), обратной очень высоко значимой связью умеренной силы с ФК стенокардии (r=-0,49, p<0,001) и стадией АГ (r=-0,37, p<0,001), обратной слабой высоко значимой корреляционной связью с ФК СН (r=-0,29, p<0,01), обратной слабой корреляционной связью с ФВ ЛЖ (r=-0,20, p<0,05).

Необходимо отметить, что остается неясным, является ли снижение уровня TRAIL результатом уменьшения продукции, либо является отражением увеличения его потребления: так, в исследовании in vitro было показано, что металлопротеиназа 2 типа, уровень которой повышен у пациентов с ОКС, способна расщеплять TRAIL [15]. Лучшее понимание точного молекулярного механизма TRAIL может стать новой мишенью для разработки новых терапевтических стратегий.

Ограничения исследования. Включение в работу пациентов, которым на основании клиникоанамнестических признаков был выставлен диагноз ИБС, однако при проведении коронарографии стенотических сужений КА выявлено не было. Вероятно, это может быть связано с наличием таких форм, как вазоспастическая либо микрососудистая стенокардия, что требует в дальнейшем более детального определения критериев включения пациентов в исследование.

Заключение

В последние годы внимание многих ученых сосредоточено на процессе апоптоза при различных заболеваниях сердечно-сосудистой системы в связи с потенциальной возможностью его контроля. Изучение маркеров апоптоза в сыворотке крови является многообещающим направлением в исследованиях атерогенеза и ИБС в связи с технической простотой получения материала и высокой информативностью результатов. Однако при изучении данных показателей отсутствует единое мнение: ряд исследователей рассматривают их с точки зрения возможной кардиопротекции, другие — как одни из звеньев патогенетического механизма. В нашей работе при изучении комплекса про- и антиапоптотических факторов продемонстрировано статистически значимое увеличение уровня Bax, p53 и снижение Bcl-2, Bcl-2/Bax и TRAIL в сыворотке крови по мере нарастания выраженности атеросклеротического поражения КА, а также выявлены корреляционные связи различной силы между лабораторными маркерами и рядом клинико-инструментальных показателей у пациентов с ИБС. Полученные данные позволяют предположить возможное использование показателей апоптоза в качестве маркеров выраженности атеросклеротических процессов, а также могут явиться плацдармом для разработки новых лечебнодиагностических подходов.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-20053, https://rscf.ru/project/22-25-20053/.