Общее в атеро и канцерогенезе: клональный гемопоэз

В обзоре раскрываются особенности происхождения и последствия клонального гемопоэза (КГ). Обзор основан на современных данных о локусной гетерогенности КГ с неопределенным потенциалом (КГНП) и плейотропном влиянии «драйверных» генов на риск сердечно-сосудистых и онкологических событий. Рассмотрен вопрос о неоднозначности риска патологий при КГНП. Кроме того, обозначены дополнительные критерии, необходимые для мониторинга КГНП.

Гемопоэз представляет собой процесс пролиферации и дифференцировки плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в клеткипредшественников лимфопоэза и миелопоэза. ГСК составляют 0,0001% от общего пула клеток костного мозга, из них в сутки лишь 3-8% подвергается дифференцировке в зрелые клетки [1]. Показано, что у взрослого человека имеется от 50 тыс. до 200 тыс. ГСК с широким диапазоном скорости самообновления от 2 до 20 мес. [2]. Помимо классического митотического деления, ГСК могут пролиферировать асимметрично, т.е. делясь на дочернюю ГСК и прогениторную клетку, способную только к дифференцировке [1][3]. Гомеостаз гемопоэза обеспечивается сложной сетью взаимодействий механизмов регуляции транскрипции, эпигенетической модификации и метаболической адаптации, находящихся под влиянием внешних факторов, а также гуморальных и локальных сигналов микроокружения костного мозга [4][5].

Соматические мутации и клональная экспансия

Несмотря на свою малочисленность, ГСК ежедневно производят от миллиона до триллиона новых клеток [6]. За 10 лет каждая пролиферирующая ГСК приобретает как минимум одну соматическую

мутацию в экзоне какого-либо гена [7]. Скорость накопления мутаций находится в пределах 1-2 мутаций за одно деление клетки [2]. Формирование мутантных ГСК как результата накопления мутаций приводит к клональной экспанcии, когда возникает нарушение кроветворения по клональному происхождению вследствие обретения подобными ГСК селективного преимущества [8][9]. Основным движущим фактором клональной экспансии являются соматические мутации, возникшие в генах, главным образом регуляторов эпигенетической модификации и клеточного цикла, что способствует их позитивной селекции [10].

Соматические мутации являются результатом стохастических событий, однако ускоренный темп их накопления во многом ассоциирован с возрастными изменениями ГСК, которые характеризуются снижением общего регенеративного потенциала [11], снижением лимфопоэза [12] и эритропоэза [13], а также смещением дифференцировки ГСК в сторону миелопоэза [14]. Дополнительным механизмом, способствующим клональной экспансии, является элиминация мутантных клонов ГСК, накопивших соматические мутации. Данный защитный механизм сокращает стволовой и прогениторный пул клеток, что способствует увеличению темпов накопления мутаций ввиду повышенной пролиферативной нагрузки на оставшиеся ГСК [15]. Укорочение теломер, возникающее при клеточном делении, увеличивает вероятность повреждений ДНК, тем самым также способствуя накоплению мутаций [15][16]. Кроме того, укорочение теломер само по себе усиливает пролиферативную активность ГСК [10]. ГСК при некоторых соматических мутациях могут не только подвергнуться апоптозу, но и перейти в стадию постоянного покоя, что в целом является сигналом активации пролиферации других ГСК [17].

Экспансия мутантных клонов не всегда сопровождается нарушением показателей крови и клиническими признаками. В норме у человека клональные соматические мутации с низкой частотой в ГСК могут наблюдаться в любом возрасте [18]. Однако для их детекции необходимо глубокое полногеномное, экзомное или таргетное секвенирование с учетом величины ошибки секвенирования.

Неопределенность риска заболеваний при КГ

Термин клональный гемопоэз применяется при наличии признаков клональной экспансии вне зависимости от варианта и стадии дифференцировки ГСК, за исключением тех случаев, когда возникает реактивная экспансия Bи Т-лимфоцитов в ответ на инфекцию или при парапротеинемиях. Для описания состояния КГ без признаков гематологических злокачественных неоплазий используют два термина: возрастной КГ и КГНП [19, 20]. Последний приобрел наибольшую популярность, т.к. выяснилось, что данное состояние может возникать не только у людей старшего поколения [18][21][22].

Под термином КГ с неопределенным потенциалом подразумевается состояние КГ как результата соматических мутаций в «драйверных» («кóровых») генах гематологических злокачественных неоплазий (далее «драйверные гены КГНП»). На данный момент их насчитывается порядка 43 (табл. 1) [23]. Анализ обогащения таких генов относительно генных онтологий указывает на роль их белковых продуктов в активации транскрипции, сплайсинге и в целом регуляции пролиферации (рис. 1 А). Однако соматические мутации, возникшие в эпигенетических регуляторах, составляют до 80% случаев КГНП [10]. Также, несмотря на наличие Х-сцепленных «драйверных» генов (табл. 1), гендерных различий по частотам КГНП обнаружено не было [10].

Стоит немного пояснить, что онтология — это формальное представление совокупности знаний в определенной области, состоящее из набора терминов с известными отношениями между ними. Например, онтология генов или генные онтологии — это совокупность знаний в области их молекулярных функций, расположения в клеточных структурах и участие в биологических процессах, которые и выступают в качестве терминов. В онтологии фенотипов, напротив, терминами выступают фенотипы болезней. При анализе обогащения онтологий относительно болезни статистическую значимость проявляют те термины, которые сильнее всего наблюдаются и отражают изучаемую патологию.

Основным критерием КГНП считается определение частоты вариантного аллеля (Variant Allele Fraction, VAF), т.е. мутационной нагрузки, пропорциональной количеству аномальных клеток [20], с помощью глубокого полногеномного, экзомного или таргетного секвенирования, а также секвенирования единичных клеток. При КГНП VAF равен или превышает 2% [24]. Порог в два процента является условным, т.к. ниже считается ошибкой секвенирования, что, естественно, не является отражением биологического смысла, а скорее технологическим ограничением [18][25]. Совершенствование технологий секвенирования, а также определение риска развития заболеваний в результате клональных мутаций с низкой частотой (VAF <2%) позволит в будущем пересмотреть данный критерий. Так или иначе, стандартизированный 2-процентный VAF порог облегчает диагностику и сравнение результатов многих исследований о распространенности КГНП [10, 26, 27].

Прежде чем перейти к дальнейшему обсуждению, необходимо уточнить, что под КГНП не понимаются гематологические неоплазии, пароксизмальная ночная гемоглобинурия (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH), моноклональная гаммапатия неопределенного значения (monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS), моноклональный В-клеточный лимфоцитоз (monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL), идиопатическая и клональная цитопении неопределенного значения (idiopathic cytopenia of unknown significance, ICUS; clonal cytopenia of unknown significance, CCUS) и идиопатическая дисплазия неопределенного значения (idiopathic dysplasia of unknown significance, IDUS) [27]. Особенностью КГНП является его «цитологическая скрытность», т.е. данное состояние не сопровождается цитопениями, дисплазиями или иными изменениями качественных или количественных показателей клеточного состава крови, изменяется лишь их клональное происхождение.

КГНП в целом считается доброкачественным состоянием. Соматические мутации, приводящие к КГНП, могут представлять не только точковые замены, но и структурные (т.е. copy number variation), геномные и хромосомные аберрации в ГСК [28]. Однако недавно было показано, что КГНП имеет значительную ассоциацию не только с острым миелоидным лейкозом, но и с формами проявления атеросклероза, такими как инсульт и острый инфаркт миокарда (ИМ) [9][29-32]. Многие «драйверные» гены вовлечены в формирование различных фенотипов, ассоциированных с аномалиями гемопоэза (рис. 1 Б).

Соматические мутации, приводящие к КГНП, не одинаково увеличивают риск малигнизации [30][33]. Обнаружено, что величина риска заболеваний обратно пропорциональна частоте соматических мутаций среди лиц с КГНП. Так, мутации в гене DNMT3A, встречающиеся в 50% случаев КГНП, повышают риск острых сердечно-сосудистых событий 1,7-кратно, в гене TET2 (частота 20%) 1,9-кратно и ASXL1 (частота 5-10%) 2-кратно. Редкие мутации в «драйверных» генах КГНП повышают риск таких событий в 2,2 раза (по медиане). Например, самая редкая мутация p.V617F в гене JAK2 имеет наиболее строгую ассоциацию с миелопролиферативными неоплазиями. Так, выявлено, что истинная полицитемия в 95% случаев является результатом мутации в гене JAK2, и вместе с тем, данная мутация в 2,09 раза увеличивает риск тромбозов и острого ИМ [32][34].

Существует прямая корреляция между соотношением уровня фракции мутантных клонов (VAF) и риском острого миелоидного лейкоза [30][32][33]. Впрочем, имеются и исключения, так, например, соматические мутации в генах TP53 и IDH2 приводят к малигнизации вне зависимости от уровня VAF, к тому же при подобных мутациях наблюдается ранняя манифестация патологии [30]. Существование ряда закономерностей между соматическими мутациями и фенотипом породило гипотезу о неслучайности накопления определенных мутаций в «драйверных» генах (далее «драйверные мутации») [35]. Для проверки данной гипотезы было проведено обследование 127 близнецовых пар в возрасте свыше 70 лет на предмет наличия одинаковых соматических мутаций [35]. Однако, как оказалось, все соматические мутации в «драйверных» генах КГНП дискордантны, иными словами, «драйверные» мутации при КГНП всё же являются результатом стохастических событий [35].

Не исключается роль и соматических мутаций, не связанных с «драйверными» генами КГНП [9][10]. Предполагается, что помимо «драйверных» мутаций общая герминативная и соматическая мутационная нагрузка может послужить важным фактором в развитии КГНП и последующего риска клинического исхода. Показано, что одни и те же мутации у разных лиц не одинаково увеличивают риск острого миелоидного лейкоза [26]. Таким образом, считается необходимым учитывать и общую мутационную нагрузку в расчете риска неоплазии и сердечно-сосудистых событий [33]. Однако, ввиду широкой локусной гетерогенности и неопределенности клинической реализации как результата КГНП, рассчитываемый риск пока трудно применить для отдельно взятого индивидуума, и он пока является общепопуляционной оценкой [10].

КГНП — предраковое или прединфарктное состояние?

Прежде всего отметим, что лейкоз, равно как и острый ИМ, не всегда является результатом КГНП. Напротив, КГНП скорее выступает новым маркером клинических исходов. Так, первые исследования показали, что у лиц с КГНП в 12 раз чаще наблюдаются опухолевые заболевания кроветворной системы [31][32]. Доказательством роли КГНП в риске острого миелоидного лейкоза послужил тот факт, что обнаруженные соматические мутации при КГНП впоследствии сохраняются во всех мутантных клонах и после развития заболевания [27, 32]. При этом структура соматических мутаций не менялась [31][36].

Известно, что соматические мутации в «драйверных» генах КГНП могут стать причиной миелопролиферативных, миелодиспластических синдромов (МДС) и острого миелоидного лейкоза. КГНП имеет много общего с МДС, т.е. группой клональных заболеваний ГСК, характеризующихся цитопениями, дисплазией миелопоэза, неэффективным гемопоэзом и повышенным риском развития острого миелоидного лейкоза [37][38].

Спектр «драйверных» генов КГНП и МДС частично совпадает, а именно гены DNMT3A, TET2 и ASXL1 [39]. МДС, как и КГНП, чаще развивается у лиц пожилого возраста, но клинически сопровождается цитопенией, имеет более сложные клинические проявления и соответствующие диагностические критерии [40][41].

Несмотря на общую между МДС и КГНП генетическую компоненту, имеется и ряд отличий. При МДС «инициирующая» мутация, возникающая в ГСК, не способна вызвать гематологическое заболевание, а возникновение дополнительных мутаций в ГСК либо в миелоидных клетках-предшественниках приводит к их пролиферативному преимуществу и нарушению способности к дифференцировке [42], благодаря чему происходит увеличение числа бластных клеток миелоидного происхождения и цитопения [43]. В случае же, если «инициирующая» мутация в ГСК вызывает селективное преимущество изначально, то это указывает на КГНП [27][32]. Поэтому в отличие от КГНП, где редко обнаруживаются несколько «драйверных» мутаций, при МДС выявляются множество соматических мутаций в разных генах, включая «драйверные» [44]. Обратной стороной КГНП являются убедительные доказательства его связи с риском клинических проявлений атеросклероза, таких как острый ИМ и инсульт [8][10][32][45]. Крупные метаанализы указывают на высокий риск атеросклероза при наличии КГНП [8][46]. На модельных животных продемонстрировано, что при КГНП происходит ускорение атеросклеротического поражения артерий [10][46][47]. Аналогичные результаты недавно были получены и для человека [10].

Результаты экспериментов указывают, что «драйверные» мутации КГНП могут изменять поведение миелоидных клеток, усиливая тем самым атеросклеротический процесс. Ускорение атерогенеза при КГНП происходит даже при незначительном увеличении VAF. Трансплантация клеток костного мозга, содержащего всего 10% мутантных клонов по гену Tet2 -/-, мышам с нокаутом по гену Ldlr-/-, приводит к явной клональной экспансии [47]. У данных мышей атеросклеротическое поражение аорты было на 60% больше по сравнению с контрольной группой [47]. Спустя 13 нед., ~70% ГСК дифференцировались преимущественно по миелоидному пути. Подобное моделирование КГНП имеет исключительную воспроизводимость [47-49].

Аналогичные результаты были получены и при моделировании КГНП с использованием мутации p.V617F в гене Jak2. Данная мутация к тому же увеличивала эритрофагоцитоз в атеросклеротических бляшках, что ускоряло их дестабилизацию [49]. Кроме того, мутация p.V617F Jak2 связана с высокой частотой тромбообразования в атеросклеротических бляшках [49][50].

КГНП повышает не только риск гематологических неоплазий и острых сердечно-сосудистых событий, но и риск формирования и тяжесть течения сердечной недостаточности (СН) [51]. Аналогичная работа с трансплантацией 10% Tet2 -/- клеток костного мозга мышам выявила связь инактивированного «драйверного» гена с высокой частотой развития СН [48]. Детальный транскриптомный анализ тканей сердца показал гиперэкспрессию генов, связанных с NLRP3-инфламмасомой, а также IL1b. Причем использование ингибитора NLRP3 снижало частоту ремоделирования сердца и развития СН у мышей [48][52][53]. Таким образом, исследования показывают, что «драйверные» мутации КГНП увеличивают в целом провоспалительную реакцию [52].

Между тем, в недавнем исследовании продемонстрирована, напротив, протективная роль КГНП в отношении болезни Альцгеймера [54]. Выявлено, что у пациентов c болезнью Альцгеймера и КГНП снижен риск развития деменции. Причем от 42 до 77% микроглии головного мозга имели те же мутации, что и мутантные клоны ГСК. Предполагается, что мутантные клоны ГСК восполняют сниженную возрастную пролиферативную активность микроглиальной системы головного мозга, тем самым предотвращая деменцию. Современные находки свидетельствуют о неоднозначном эффекте КГНП на организм, что помимо ассоциаций «драйверных» генов КГНП с риском патологических состояний, обнаруживаются и ассоциации с протективным эффектом [55].

Таким образом, КГНП можно назвать и факультативным предраковым и латентным прединфарктным состоянием одновременно, но это не отменяет его доброкачественность и в то же время непредсказуемость. Риск заболеваний при КГНП повышается, но и оценка риска усложняется ввиду неопределенности клинической реализации в результате КГНП. Как оценить, по какому именно сценарию произойдет то или иное событие и произойдёт ли в ближайшее время, до конца не ясно (рис. 2). К примеру, сообщается, что персистенция соматических мутаций в «драйверных» генах DNMT3A, TET2 и ASXL1 после проведения химиотерапии никак не влияет на риск рецидива лейкоза [56]. В ином случае лица с острым миелоидным лейкозом, развившимся на фоне КГНП, напротив, имеют повышенный риск вторичной неоплазии, чем у лиц без КГНП [56]. Мультипотентность КГНП поразительна тем, что может развиться сначала ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома, к которой вскоре присоединится острый миелоидный лейкоз [57].

Темп роста клональной экспансии

Одним из направлений исследования по влиянию длительного пребывания в космическом пространстве, проведенного Национальным управлением по аэронавтике и исследованию космического пространства (NASA), являлось использование близнецовой пары⁴, когда один из братьев находился на космической станции в космосе, другой — на земле. Это позволило провести сравнительную оценку скорости клональной экспансии у близнецов, находившихся в разных радиационных условиях, но имеющих одинаковую герминативную мутационную нагрузку (генетический фон) [22], т. е. общее количество герминативных (унаследованных) мутаций (изменений), влияющих на риск реализации сложного фенотипа, таким образом ставится в противовес соматической мутационной нагрузке (общее количество приобретенных мутаций в ходе онтогенеза в соматических клетках). Отсюда реализация фенотипа корректируется герминативной мутационной нагрузкой при появлении новых соматических мутаций.

В дополётный период у космонавта в возрасте 50 лет идентифицирована соматическая миссенсмутация в гене TET2 (VAF=4%), а у его братаблизнеца две мутации в гене DNMT3A (VAF=2% и 7%). Спустя 3,5 года выявлено, что у брата, находившегося на земле, скорость прироста одного мутантного клона увеличилась с VAF=2% до 5%, а второй мутантный клон остался без изменений, тогда как у экс-космонавта увеличилась доля VAF с 4% до 7% [22].

Схожее, но ретроспективное обследование 14 космонавтов (возраст по медиане 42 года), совершавших полеты с 1998 по 2001гг, выявило у них соматические мутации в 17 «драйверных» генах КГНП, из них чаще всего были затронуты TP53 и DNMT3A [21]. Глубокое секвенирование образцов ДНК периферической крови индивидов, полученных спустя 3 дня после их приземления, показало признаки начального КГ, а также наличие клональных мутаций с низкой частотой (медиана VAF=0,18%, максимальное VAF=1%) в «драйверных» генах КГНП. К сожалению, оценка уровня и структуры КГНП по истечении 20 лет после полета в космос не была проведена [21].

Таким образом, мониторинг скорости экспансии мутантных клонов в крови также является важным показателем для определения общего риска онкологических и сердечно-сосудистых событий, а не только одномоментное определение VAF в «драйверных» генах КГНП. Объясняется это тем, что начало и скорость прироста КГ отличается не только между людьми, но и между мутантными клонами [10][22]. Существует ли закономерность между темпами экспансии мутантных клонов и определенной соматической мутации или это зависит от еще каких-то факторов, предстоит выяснить.

Заключение

Высокая заболеваемость и смертность от сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, вкупе с их прочной связью c КГ, делает КГНП достойным пристального внимания. В особенности, учитывая интерес к мутантным клонам как к мишеням для таргетной терапии [58][59]. Кроме того, слабая изученность и упущенные детерминантные сигналы клинических исходов КГНП только стимулируют всплеск интереса к проблеме КГНП. Очевидно, клональный компонент в атерогенезе протекает не по стандартному воспалительному поликлональному сценарию, а напротив, по олигоклональному с появлением моноклональных очагов, обладающих значительным преимуществом в пролиферации за счет клональной эволюции с приобретением способности выживать в токсичной среде атеросклеротической бляшки [60].

Нарушение эпигенетической регуляции является одним из ключевых механизмов КГНП, который может подтолкнуть клетку к клональной экспансии. К примеру, соматические мутации могут приводить к неспособности гемопоэтической клетки точно воспроизвести заложенные эпигенетические маркеры во время деления. Для одних клеток это означает нарушение дальнейшей пролиферации и дифференцировки, а для других, напротив, к повышенной пролиферации, в зависимости от того, какие эпигенетические маркеры были утрачены. Подобные события приводят к клональной эволюции с появлением новых клонов со всё новыми свойствами, главным образом, с пролиферативным преимуществом, своего рода дарвиновского отбора в онтогенезе человека, где активная экспансия клонов является залогом успеха за места в пуле ядросодержащих клеток.

Однако на сегодняшний день экспериментально не подтверждена, но и не опровергнута связь между конкретными эпигенетическими изменениями и клональной экспансией. Помимо этого, многие механизмы ассоциации КГНП с риском развития патологий по-прежнему остаются не раскрытыми.

Отношения и деятельность. Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 22-2500745.