Варианты генов ANGPTL3, ANGPTL4, APOA5, APOB, APOC2, APOC3, LDLR, PCSK9, LPL и риск ишемической болезни сердца

В Российской Федерации сердечно-сосудистые заболевания на протяжении многих лет являются основной причиной смерти населения. Так, в 2017г от сердечно-сосудистых заболеваний умерло 862895 человек, среди умерших доля ишемической болезни сердца (ИБС) составила 52% [1]. Для предотвращения смертельных случаев от ИБС необходимо максимально рано начинать профилактику данного заболевания в группах повышенного риска [2][3]. Исследования больших когорт пациентов с ИБС в странах Западной Европы и США позволили выявить гены, варианты которых связаны с изменением уровней холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛНП) и/или триглицеридов (ТГ) в крови пациентов и с риском развития ИБС: ANGPTL3, ANGPTL4, APOA5, APOB, APOC2, APOC3, LDLR, PCSK9, LPL [4][5]. При этом часть вариантов в этих генах связана с повышенным уровнем ХС ЛНП и ТГ и, соответственно, повышает риск ИБС, а  другая часть вариантов — с пониженным уровнем ХС ЛНП и ТГ, и сниженным риском ИБС. В России подобные исследования не проводились, однако применение генетической диагностики для оценки риска развития ИБС выглядит многообещающей идеей в контексте первичной профилактики.

Цель исследования — изучение вклада редких и низкочастотных вариантов генов ANGPTL3, ANGPTL4, APOA5, APOB, APOC2, APOC3, LDLR, PCSK9, LPL при оценке риска ИБС в когорте российских пациентов с различным сердечно-сосудистым риском.

Материал и методы

Исследование проводилось на выборке из участников когортных и эпидемиологических исследований, наблюдаемых в ФГБУ "НМИЦ ТПМ" Минздрава России (n=2405) [6-8]. Всем пациентам проводилось клиническое, лабораторное и инструментальное обследование на предмет исключения или подтверждения у них наличия ИБС, и генетическая диагностика.

Диагноз ИБС устанавливали при наличии: 1) положительного электрокардиографического теста с нагрузкой, 2) в анамнезе пациента перенесённого документированного инфаркта миокарда, 3) на коронарографии гемодинамически значимого поражения коронарного русла — >50% для ствола левой коронарной артерии или >70% при иной локализации, 4) в анамнезе пациента документированных эндоваскулярных коронарных вмешательств или операции коронарного шунтирования. Также учитывался возраст развития ИБС у пациента.

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования был одобрен этическими комитетами всех участвующих клинических центров. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие.

Генетическая диагностика. Кровь от пациентов собирали в пробирки с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Хранили при -20° С. Геномная ДНК была выделена из 200 мкл замороженной крови при помощи набора DNA blood mini kit (Qiagen, США). Для секвенирования геномные библиотеки были приготовлены с помощью набора SeqCap EZ Prime Choice Library kit (Roche, Швейцария). Далее было выполнено таргетное обогащение кодирующих последовательностей и экзон-интронных участков девяти генов ANGPTL3, ANGPTL4, APOA5, APOB, APOC2, APOC3, LDLR, PCSK9, LPL с использованием набора SeqCap EZ Prime Choice Probes (Roche, Швейцария). Контроль качества был проведен с помощью Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, США) и Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США). Генетическая диагностика проведена методом секвенирования следующего поколения на секвенаторе NextSeq 550 (Illumina, США). Все этапы эксперимента проводились согласно протоколам производителей.

Биоинформатический анализ. Парные чтения, полученные после секвенирования, были предоставлены для анализа в формате fastq. Оценка качества чтений была проведена с помощью программы FastQC, после чего при помощи программы Trimmomatic с конца каждого чтения были удалены нуклеотиды, вероятность ошибки в которых была >1 на 100. Прошедшие процедуру фильтрации пары чтений были картированы на геном человека версии hg19, в качестве картировщика выбрана программа bwa mem. Удаление дублированных чтений осуществлено с помощью программы samtools. В результате для каждого пациента был получен BAM-файл, содержащий информацию об уникальных чтениях, картированных на референсный геном. Неточности выравнивания в областях вставок и делеций были устранены при помощи программы GATK, также с помощью GATK проводили поиск вариантов нуклеотидной последовательности (ВНП) в координатах целевых участков генома и фильтрацию по качеству в соответствии с рекомендациями GATK. В результате для каждого пациента были получены файлы, содержащие список ВНП, их координаты, данные о покрытии и прочие характеристики. Найденные ВНП были проаннотированы с помощью программы ENSEMBL VEP.

Все найденные ВНП аннотировались и фильтровались согласно данным о частоте встречаемости минорного аллеля и результатах компьютерного предсказания влияния на структуру белка изменений нуклеотидной последовательности (SIFT и PolyPhen2 для несинонимичных). ВНП проходили проверку на соответствие критериям патогенности согласно рекомендациям ACMG 2015г. Отфильтрованные варианты с высоким качеством перед включением в результаты генетического исследования анализировались врачом и исследовались на предмет упоминания в новейших публикациях.

Статистический анализ. Cтатистический анализ выполнен с помощью программы IBM SPSS версия 28.0.0.0. Проводился анализ выживаемости с помощью процедуры Каплана-Мейера и регрессии Кокса для пациентов трех групп: лица с генетическими вариантами, связанными с повышенным уровнем ХС ЛНП и/или ТГ; лица с генетическими вариантами, связанными со сниженным уровнем ХС ЛНП и/ или ТГ; лица без генетических вариантов, связанных с уровнем ХС ЛНП и/или ТГ или с двумя или более вариантами с противоположным эффектом на уровень ХС ЛНП и/или ТГ. Учитывался факт и возраст развития ИБС. При проведении процедуры Каплана-Мейера построен график накопленного риска развития ИБС для каждой из трех групп, в качестве статистического теста использован лог-ранговый критерий. При проведении регрессии Кокса в качестве переменных использованы: факт отнесения пациентов к одной из трех групп на основании данных генетической диагностики, пол, возраст, уровень ХС ЛНП до начала гиполипидемической терапии, наличие артериальной гипертензии (АГ), факт курения. В качестве оценки вклада параметра приводится отношение рисков (ОР) и 95% доверительный интервал (ДИ). Уровень значимости принят равным 0,05.

Результаты

Данное исследование реализовывалось в виде наблюдения на выборке из пациентов с разной категорией сердечно-сосудистого риска, в т.ч. с наличием ИБС. Всего в исследование было включено 2405 пациентов — 905 мужчин и 1500 женщин. Средний возраст пациентов составил 51,32±12,22 лет. ИБС была подтверждена у 267 пациентов (11%). После проведения генетической диагностики все пациенты были разделены на 3 группы: группа 1 — лица с генетическими вариантами, связанными с повышенным уровнем ХС ЛНП и/или ТГ (n=160); группа 2 — лица с генетическими вариантами, связанными со сниженным уровнем ХС ЛНП и/или ТГ (n=199); группа 3 — лица без генетических вариантов, связанных с уровнем ХС ЛНП и/или ТГ или с двумя или более вариантами с противоположными эффектами на уровень ХС ЛНП и/или ТГ (n=2046). При проведении процедуры Каплана-Мейера выявлено, что группы достоверно различаются по накопленному риску развития ИБС (р<0,001 для лог-рангового критерия), максимальный риск был в группе 1, а  минимальный риск в группе 2 (рис. 1). При проведении регрессии Кокса было выявлено, что у лиц из группы 1 ОР развития ИБС выше в 2,63 раза — ОР =2,63 (95% ДИ 1,6-4,34; р<0,001), а  у лиц из группы 2 ниже в 1,88 раза — ОР =0,53 (95% ДИ 0,3-0,98; р=0,042) по сравнению c лицами из группы 3 с поправкой на другие факторы риска ИБС: пол, возраст, факт курения, уровень ХС ЛНП и наличие АГ (табл. 1).

Обсуждение

В работе, используя данные генетической диагностики, проводился анализ Каплана-Мейера и регрессия Кокса для оценки риска развития ИБС у участников исследования. Было показано, что наличие у пациента редкого или низкочастотного варианта в одном из изучаемых генов: ANGPTL3, ANGPTL4, APOA5, APOB, APOC2, APOC3, LDLR, PCSK9 или LPL, связанного с уровнем ХС ЛНП и/или ТГ достоверно, с поправкой на другие факторы риска, влияет на риск ИБС. Ранее в нескольких работах проводилось сравнение рисков развития ИБС у носителей редких вариантов генов, связанных с развитием семейной гиперхолестеринемии, лиц с высоким баллом значения полигенной шкалы генетического риска (ШГР) на основе частых вариантов и у лиц без генетически детерминированного риска. Было показано, что наибольшее ОР раннего развития ИБС (ОР =3,06 (1,56-5,99), p=0,001) было у лиц с наличием редких вариантов генов LDLR, APOB, PCSK9 в комбинации со значением балла >80 перцентиля ШГР28 на основе 28 частых вариантов, лица только с редкими вариантами генов LDLR, APOB, PCSK9 имели промежуточный риск (ОР =1,97 (1,09-3,56), p=0,02), а  лица только со значением балла >80 перцентиля ШГР28 достоверно не отличались от референсной группы (ОР =1,39 (0,79-2,47), p=0,3) в модели с поправкой на пол, возраст, уровень ХС ЛНП, наличие АГ и сахарного диабета [9]. В когорте лиц с гиперхолестеринемией из UK биобанка было показано, что наибольшее ОР развития ИБС (ОР =1,93 (1,32-2,81) p=0,001) было у пациентов с наличием редких ВНП генов LDLR, APOB, PCSK9, лица со значением балла полигенной ШГР223 >95 перцентиля на основе 223 частых вариантов имели промежуточный риск (ОР =1,29 (1,05-1,59), p=0,01), по сравнению с референсной группой в модели с поправкой на уровень ХС ЛНП [10]. Представленные работы подтверждают полученные нами результаты о значимости генетической диагностики в оценке риска ИБС. Генетический риск ИБС, основанный на наличии определенных изменений в ДНК человека, может быть рассчитан при однократном анализе уже в детском или молодом возрасте и этот риск не изменяется с возрастом. Генетический тест может быть выполнен в любой точке мира из образца крови или слюны пациента. Такой подход позволяет выявлять лиц с высоким риском ИБС и начинать профилактические мероприятия у них максимально рано, что способствует их большей эффективности.

Заключение

Применение генетического тестирования у молодых пациентов позволяет выявить лиц с повышенным генетическим риском ИБС и сфокусировать проведение профилактических и лечебных мероприятий прежде всего для данной категории пациентов.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.