Уровень микро-РНК у больных стабильной ишемической болезнью сердца с пограничными стенозами коронарных артерий

Полученные данные о циркулирующих микроРНК (мРНК) произвели революцию в области молекулярной биологии благодаря их потенциалу в качестве диагностического и прогностического биомаркера сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). мРНК являются внутриклеточными тканеспецифическими молекулами, не подвергающимися разрушению ферментами РНКазами. Они высвобождаются в циркуляторное русло различными путями, включая активную секрецию, а поптоз или некроз. Так как ряд нуклеотидных последовательностей поступает из клеток в жидкие среды организма, в т.ч. и в кровь, то уровень их экспрессии легко доступен оценке. мРНК принимают участие в патогенезе атеросклероза на всех его этапах [1]. В последние годы появились работы, посвящённые роли мРНК в прогрессировании коронарного атеросклероза. Однако сведения о взаимосвязи мРНК со степенью тяжести и распространенностью атеросклероза коронарных артерий (КА) противоречивы [1][2].

Показано, что мРНК в качестве внутрии межклеточных сигнальных молекул воздействуют на эндотелиальные клетки. Некоторые мРНК, например, мРНК-126, участвуют в регуляции воспаления в сосудистой стенке, контролируют экспрессию молекул адгезии VCAM-1, ICAM-1, E-SEL в эндотелиоцитах [3]. Атеропротективные свойства мРНК-126 реализуются посредством влияния на ангиогенез и репарацию эндотелиальных клеток [4][5].

мРНК-21 представляет собой 22-нуклеотидную длинную мРНК, которая участвует в развитии различных ССЗ, включая сердечную недостаточность, дилатационную кардиомиопатию, инфаркт миокарда (ИМ) и диабетическую кардиомиопатию. Экспрессия мРНК-21 обеспечивает протекторную роль после повреждения мышцы сердца. Помимо этого, экспрессия мРНК-21 тесно связана с гипертрофией левого желудочка и фиброзом миокарда [6].

Увеличение экспрессии мРНК-21 может быть полезно в прогнозировании сердечно-сосудистых событий у бессимптомных пациентов в т.ч. при сахарном диабете (СД) 2 типа. Влияние на мРНК-21 уменьшает площадь ИМ и защищает кардиомиоциты от дальнейших повреждений и гибели за счет уменьшения области ишемии миокарда и степени его повреждения [7].

мРНК-22 является мощным ингибитором аутофагии кардиомиоцитов. Уровень экспрессии специфического мРНК-22 увеличивается в процессе старения кардиомиоцитов. Ингибирование мРНК-22 в стареющих кардиомиоцитах способствует активации аутофагии и торможению патологической гипертрофии. По данным Гареева И. Ф. и др. применение антимРНК-22 после ИМ у пожилых мышей предотвратило ремоделирование сердца и улучшило функцию сердца с помощью активации сердечной аутофагии [7].

мРНК-126 идентифицирована как основной регулятор компенсаторного ангиогенеза, стимуляция которого рассматривается как новая возможная стратегия лечении ишемии миокарда [8]. СД заметно снижает экспрессию белков мРНК-126. С другой стороны, по данным Venkat P, et al. [9] увеличение экспрессии мРНК-126 за счет активации пути ангиогенеза в ткани сердца возможно на фоне высокоинтенсивных интервальных тренировок. А поскольку усиление ангиогенеза через путь мРНК-126 жизненно важно для компенсации повреждения сердца, вызванного диабетом, использование стандартных интервальных упражнений может обсуждаться в качестве новой терапевтической цели при диабетической кардиомиопатии.

По данным Ghorbani S, et al., уровни мРНК-21 и мРНК-126 существенно не различались в сыворотке между пациентами с СД и без него. Однако уровень мРНК-21 у пациентов с ожирением был значительно ниже, чем у худых субъектов независимо от наличия СД. Была выявлена значительная отрицательная корреляция между количеством мРНК-21 и индексом массы тела (ИМТ), окружностью талии, уровнями инсулина и HOMA-IR у лиц с отсутствием и наличием СД [10].

Экспрессия циркулирующей мРНК-221/222 повышена у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) и положительно коррелирует с тяжестью поражения КА. Циркулирующие мРНК-221/222 могут быть рассмотрены как новые биомаркеры для диагностики стеноза КА ≥50% и возникновения ОКС [11].

Целью исследования явилось изучение уровня мРНК-21, -22 -126, -221 у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) с пограничными стенозами КА в зависимости от сопутствующей патологии и гендерной принадлежности.

Материал и методы

На базе ГБУЗ НСО "Новосибирский областной клинический кардиологический диспансер" обследовано 37 больных стабильной ИБС с пограничными стенозами КА. Протокол исследования одобрен комитетом по этике ФГБОУ ВО "Новосибирский государственный медицинский университет" Минздрава России (№ 129 от 30.11.2020г). Всем пациентам проводились общеклиническое обследование, ультразвуковое исследование сердца и коронароангиография. Наличие ожирения определялось по критериям Всемирной организации здравоохранения (ИМТ ≥30). Критерии включения в исследование: стабильная ИБС с пограничными (40-70%) стенозами КА; возраст до 60 лет; подписанное добровольное информированное согласие. Критерии невключения: ИМ и ОКС давностью <6 мес.; ранее перенесенные оперативные вмешательства на КА; онкологические заболевания; хронические заболевания в стадии обострения; острые инфекционные заболевания; психические заболевания; семейная гиперхолестеринемия.

Сбор и хранение образцов плазмы крови пациентов с диагнозом ИБС. 37 образцов плазмы от пациентов с диагнозом ИБС были собраны в Новосибирском областном клиническом кардиологическом диспансере в 2021-2022гг. Сбор крови производился в вакутейнеры с ЭДТА (Cerebrum, Китай) с последующим отделением плазмы центрифугированием. Полученная плазма крови хранилась при -70° С до проведения экспериментов.

Выделение мРНК. Выделение фракции мРНК из плазмы крови пациентов осуществлялось реагентом TRIzol™ LS Reagent (Invitrogen™, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Выделенный генетический материал хранился при -70° С.

Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени. Относительные уровни экспрессии мРНК измеряли с помощью ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием "stem-loop" праймеров и коммерческого набора RT-M-MuLV-RH (БиолабМикс, Россия). ПЦР в реальном времени проводили с использованием реакционной смеси БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (2×) (БиолабМикс, Россия). Для обнаружения продуктов ПЦР применяли систему обнаружения CFX96™ (Bio-Rad Laboratories, США). мРНК-16 использовали для нормализации данных.

Использовались следующие праймеры для обратной транскрипции: мРНК-16 5’-GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG ACCGCCAAT-3’; мРНК-21 5’-GTCGTATCCAGTGC AGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCA ACATC-3’; мРНК-22 5’-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT CT-3’; мРНК-126 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC CGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCATTAT-3’; мРНК-221 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACGAAACCCA-3’.

Для обратной транскрипции-ПЦР использовали следующие специфические олигонуклеотиды:

1) Прямые праймеры:

мРНК-16 5’-GGCGTAGCAGCACGTAAAT-3’; мРНК-21 5’-GCCGCTAGCTTATCAGACT-3’; мРНК-22, 5’-GCCGAAGCTGCCAGTTGA-3’; мРНК-126, 5’-GCCGCTCGTACCGTGAGTA-3’; мРНК-221, 5’-GCCGCAGCTACATTGTCTGC-3’;

2) Обратный праймер:

5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’.

Каждый образец анализировали в трех повторах. Относительный уровень экспрессии оценивали на основе значений порогового цикла (Ct) с учетом эффективности ПЦР (E) как для анализируемой, так и для эталонной мРНК.

Статистический анализ. Для статистического анализа данных использовалось Программное обеспечение STATISTICA (версия 12; TIBCO Software Inc., США). Данные представлены в виде медианных значений. Статистический анализ проводили с использованием непараметрического U-критерия МаннаУитни. Данные с p<0,05 считались статистически значимыми.

Работа выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования "Протеомный анализ".

Результаты

Анализ выборки 37 больных стабильной ИБС (стенокардия напряжения 1-3 функционального класса; 18 мужчин и 19 женщин) с пограничными стенозами КА позволил распределить обследованных на 3 группы исходя из преобладающей клинико-анамнестической картины. Первую группу составили 17 пациентов со стабильной ИБС с пограничными стенозами КА без ожирения и СД (55,1 [ 50; 57] лет, 9 мужчин и 8 женщин), вторую — 13 пациентов со стабильной ИБС с пограничными стенозами КА и метаболически неблагоприятным (нездоровым) фенотипом ожирения (МНФО) без СД (54 [ 49; 58] лет, 7 мужчин и 6 женщин), и третью — 7 пациентов со стабильной ИБС с пограничными стенозами КА с СД 2 типа (56 [ 53; 59] лет, 2 мужчины и 5 женщин), таблица 1. У всех обследованных имела место гипертоническая болезнь с наличием артериальной гипертензии 1-2 степени.

При определении связи уровней мРНК в плазме с различными фенотипами больных ИБС с пограничными стенозами КА результаты нормировали либо к случаям без МНФО и СД, либо к случаям без СД.

Проведенный анализ выявил повышение уровня мРНК-221 в группе больных со стабильной ИБС с пограничными стенозами КА с наличием МНФО, но без СД (р=0,042), и повышение уровня мРНК-22 и мРНК-126 в группе больных со стабильной ИБС с пограничными стенозами КА и СД (р=0,007 и р=0,034, соответственно), таблица 2. При дифференцировке групп по наличию и отсутствию СД уровень мРНК-22 и мРНК-126 был более высоким у пациентов с наличием диабета (3 группа).

При гендерном анализе концентрации мРНК без учета фенотипа больных стабильной ИБС с пограничными стенозами КА обнаружены более высокие значения уровня мРНК-21 и мРНК-221 у мужчин в сравнении с женщинами (р=0,021 и 0,014 соответственно; табл. 3).

Уровень мРНК-22 был достоверно выше в плазме крови мужчин со стабильной ИБС с пограничными стенозом КА при наличии МНФО и СД (группы 2 и 3); р=0,048, таблица 4.

У женщин со стабильной ИБС с пограничными стенозами КА содержание мРНК-126 было выше при наличие сопутствующего СД (3 группа) как в сравнении с больными ИБС без МНФО и СД (1 группа; р=0,018), так с объединенной группой больных с ИБС без МНФО и СД и ИБС с МНФО без СД (2 группа; р=0,007). Кроме того, у женщин с наличием СД были значимо выше уровни мРНК-22 и мРНК-221 (р=0,025 и р=0,043, соответственно), таблица 5.

Обсуждение

Наши данные, полученные на небольшой выборке пациентов ИБС с пограничными стенозами КА, позволили выявить определенный дисбаланс уровня мРНК в зависимости от коморбидной патологии. Так, уровень мРНК-221 был выше в группе больных с наличием МНФО, но без СД (р=0,042), что согласуется с данными ряда авторов [12][13], которыми было обнаружено, что уровень экспрессии мРНК-221 и -221/222 повышен у лиц с ожирением, а  повышенная экспрессия мРНК-221/222 в сосудах людей с ожирением, метаболическим синдромом, инсулинорезистентностью, гипертонией и СД 2 типа увеличивала риск ССЗ и способствовала развитию атеросклероза через эндотелиальную дисфункцию и неоинтимальную гиперплазию [11]. Также нами было обнаружено повышение значений мРНК-22 и мРНК-126 в группе больных со стабильной ИБС с пограничными стенозами КА и СД (р=0,007 и р=0,034, соответственно). Следует отметить, что данные о повышение мРНК-126 у больных с СД противоречивы и требуют дальнейшей детализации и уточнения, поскольку в литературе имеются указания и на возможности снижения уровня мРНК-126 при СД [9][14]. Данные по гендерным особенностям уровня мРНК у больных ИБС в литературе ограничены. Основное количество публикаций по концентрации мРНК в зависимости от пола касаются онкологической патологии различной локализации. Имеются лишь ограниченные публикации, касающиеся уровня мРНК-126 при СД у женщин [14]. Повышение уровня мРНК-221 у лиц женского пола описано в исследовании Ojeda-Rodriguez A, et al., в котором участвовала 51 испанская девочка (возраст 7-16 лет) с абдоминальным ожирением. Экспрессия мРНК-221-3p положительно коррелировала с ИМТ и окружностью талии и отрицательно — с количественным контрольным индексом чувствительности к инсулину. Таким образом, оценка мРНК-221-3p может быть использована для прогнозирования ответа на междисциплинарное вмешательство по снижению веса у лиц женского пола [12].

Исходя из выше представленного, наши данные по гендерным особенностям концентрации мРНК у больных стабильной ИБС с пограничными стенозами КА и сопутствующей патологией требуют дальнейшей разработки и осмысления полученных результатов.

Заключение

Таким образом, изучение содержания мРНК у больных ИБС с пограничными стенозами КА, как одной из наиболее частных форм поражения коронарного русла как у мужчин, так и у женщин, представляет большой интерес, содержит достаточно много неоднозначных и нерешенных проблем, но, несомненно, является перспективным направлением для дальнейшего использования в диагностических и лечебных целях.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.