Количественная оценка исходной концентрации кальций-фосфатных бионов как скринингового маркера минерального гомеостаза крови у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и у пациентов с хронической болезнью почек

Нарушения минерального гомеостаза в зависимости от своей тяжести могут привести к повышению уровней ионизированного кальция и фосфора до "высоких нормальных" значений или даже к превышению их физиологической нормы. Эпидемиологические исследования показали, что "высокие нормальные" уровни ионизированного кальция и фосфора ассоциированы с повышенным риском развития инфаркта миокарда (ИМ) и ишемического инсульта (ИИ) [1], а также микрососудистой дисфункции [2], которая коррелирует с относительно высокой вероятностью острых сердечно-сосудистых событий, хронической сердечной недостаточности и смерти от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) [3].

Помимо системы кальциетропных и фосфотропных гормонов и их рецепторов, а также ионов магния, уровень ионизированного кальция в крови контролируется циркулирующими кислыми белками — так называемыми минеральными шаперонами [4], которые связывают положительно заряженные ионы кальция за счет отрицательно заряженных аминокислот в своей структуре. Основными минеральными шаперонами сыворотки крови человека являются альбумин (до 60% всех белков крови) и фетуин-А, который обладает чрезвычайно высокой емкостью связывания как ионов кальция, так и зарождающихся фосфорнокальциевых кластеров [5]. По аналогии с "высоким нормальным" уровнем кальция и фосфора, "низкий нормальный" уровень альбумина и фетуина-А также ассоциирован с повышенным риском развития ИМ, ИИ и сердечно-сосудистой смерти [6]. В результате связывания фетуина-А с фосфатом кальция происходит формирование кальципротеиновых мономеров и наноразмерных частиц — кальций-фосфатных бионов (КФБ), также называемых кальципротеиновыми частицами, агрегирующих избыточный ионизированный кальций и фосфат-анионы и выводящих их из кровотока [7]. Эксперименты по моделированию влияния КФБ на сосудистую стенку показали, что данные частицы интернализуются эндотелиальными клетками, вызывая их гибель посредством пермеабилизации лизосомальной мембраны [7] и способствуя формированию провоспалительного микроокружения, приводящего к развитию дисфункции эндотелия [8] и формированию неоинтимы [7][8]. Таким образом, КФБ, с одной стороны, выполняют жизненно важную функцию системных скевенджеров избыточного кальция и фосфора, а с другой — способствуют развитию дисфункции эндотелия, являющейся обязательным триггером развития атеросклероза.

В последние годы был разработан метод прямой детекции (определения исходной концентрации) КФБ в сыворотке или плазме крови при помощи связывания КФБ флюоресцентно меченым бисфосфонатом (OsteoSense 680EX) в сочетании с дифференциальным окрашиванием имеющих сходную размерность внеклеточных везикул липофильным мембранным красителем PKH67 [9]. Несмотря на активное использование этого метода у пациентов с требующей гемодиализа хронической болезнью почек (ХБП) [10][11], количественного измерения КФБ в сыворотке крови пациентов с ССЗ, тем более в контексте иных нарушений минерального гомеостаза, до настоящего времени проведено не было.

Материал и методы

В исследование было включено 308 субъектов: 1) 88 участников эпидемиологического исследования PURE (Prospective Urban Rural Epidemiology Study), обследованных на базе НИИ КПССЗ и не имеющих гемодинамически значимого каротидного атеросклероза (стеноз >50% просвета сосуда) по данным ультразвуковой допплерографии и симптоматического коронарного атеросклероза в анамнезе; 2) 88 пациентов с цереброваскулярной болезнью (ЦВБ), поступивших в нейрохирургическое отделение ГБУЗ КО "КОККД им. акад. Л.С. Барбараша" с потребовавшим проведения каротидной эндартерэктомии атеросклерозом сонных артерий (44 пациента с ИИ и 44 пациента с хронической ишемией головного мозга (ХИГМ)); 3) 88 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), потребовавшей чрескожного коронарного вмешательства (44 пациента с ИМ, поступивших в кардиологическое отделение ГБУЗ КО "КОККД им. акад. Л.С. Барбараша") или коронарного шунтирования (44 пациента с хроническим коронарным синдромом (ХКС), поступивших в кардиохирургическое отделение НИИ КПССЗ); 4) 63 пациента с ХБП 5 стадии (ХБП5) (определяемой как скорость клубочковой фильтрации <15 мл/ мин/1,73 м2 по формуле CKD-EPI), поступивших в Центр нефрологии и гемодиализа ГАУЗ "КОКБ им. С.В. Беляева". Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом НИИ КПССЗ (дата заседания 10.09.2018, протокол № 80/2018). До включения в исследование от всех пациентов было получено письменное информированное согласие. Гендерно-возрастные характеристики, коморбидные патологии и фармакологический анамнез включенных в исследование субъектов приведены в более ранней статье нашей группы [12].

У включенных в исследование пациентов при помощи автоматизированного биохимического анализатора (Konelab 60i, Thermo Scientific) были определены параметры, определяющие системный минеральный гомеостаз: уровень общего и ионизированного кальция, фосфора, а также концентрации общего белка и альбумина. Концентрацию фетуина-А в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (RD191037100, BioVendor) согласно протоколу производителя на спектрофотометре Multiskan Sky (Thermo Scientific).

С целью прямой детекции КФБ в сыворотке крови использовали флюоресцентно меченный бисфосфонат OsteoSense 680EX (NEV10020EX, Perkin-Elmer), тропный к фосфату кальция, и липофильный флюоресцентный краситель PKH67 (MIDI67-1KT, SigmaAldrich), связывающийся с липидами, согласно авторской методике [9]. Такое сочетание красителей позволило надежно дифференцировать КФБ от внеклеточных мембранных везикул. Для проведения анализа сыворотку включенных в исследование пациентов после разморозки центрифугировали при 3500 × g в течение 5 мин (Microfuge 20R, Beckman Coulter) для осаждения криопреципитата. Затем в новую пробирку с номером исследуемого пациента было аликвотировано 50 мкл чистого надосадка, который был разведен в соотношении 1:5 в дважды отфильтрованном через поры диаметром 220 нм Tris-буферном растворе (TBS, pH 7,4, 252859, Sigma-Aldrich). Далее образцы были вновь центрифугированы для осаждения нецелевого крупного дебриса при 10000 × g в течение 15 мин при 4⁰ C. Для дальнейшего окрашивания 200 мкл надосадка были смешаны с 250 мкл флюоресцентного меченного бисфосфоната OsteoSense 680EX (предварительно разведенного в соотношении 1:75 в вышеуказанном TBS) и инкубированы в течение 50 мин в темноте при 4⁰ C. По истечении времени инкубации в пробирку было добавлено 25 мкл флюоресцентного красителя PKH67 (растворенного в специальном растворителе Diluent C в соотношении 1:100 согласно инструкции к набору), с дальнейшим ресуспендированием и инкубацией в темноте в течение 10 мин при 4⁰ C.

Далее был проведен анализ образцов на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter). В качестве отмывочной жидкости была использована отфильтрованная через поры диаметром 220 нм бидистиллированная вода. Для детекции флюоресцентного красителя OsteoSense 680EX был применен лазер c длиной волны 638 нм (фильтр 712/25 BP), для детекции PKH67 — лазер c длиной волны 488 нм (фильтр 525/40 BP). В качестве положительного контроля для установки напряжения каналов флюоресценции были использованы искусственно синтезированные КФБ [8]. В качестве отрицательного контроля (холостые пробы) для установки напряжения каналов флюоресценции и ежедневной проверки сходимости показаний прибора были использованы рабочие растворы обоих указанных флюоресцентных красителей, смешанные с чистым TBS без внесения сыворотки пациентов, а также сыворотка пациентов без внесения флюоресцентных красителей. КФБ детектировались как OsteoSense 680EX-положительные PKH67-отрицательные события.

Для сбора событий была установлена минимально возможная скорость 10 мкл/мин, что позволяло минимизировать детекцию ложноположительных "засвеченных частиц". Для максимальной стабилизации сигнала начало записи событий осуществлялось через 30 сек после загрузки образца в проточный цитометр. Длительность регистрации событий в каждом образце составила 2 мин, для повышения точности анализа все измерения были проведены дважды. Для исключения кросс-контаминации между различными образцами после анализа каждого образца дважды выполнялась короткая промывка прибора.

Статистический анализ был выполнен в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). Сравнения между группами были проведены при помощи критерия Краскела-Уоллиса, при этом поправка на множественные сравнения была осуществлена посредством расчета средней доли ложных отклонений гипотез (FDR). Значения p<0,05 признавались статистически значимыми.

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2022-0001 "Молекулярные, клеточные и биомеханические механизмы патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний в разработке новых методов лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы на основе персонифицированной фармакотерапии, внедрения малоинвазивных медицинских изделий, биоматериалов и тканеинженерных имплантатов".

Результаты

При измерении молярной концентрации общего кальция в сыворотке крови было выявлено, что пациенты с ЦВБ (ХИГМ, ИИ), ИБС (ХКС, ИМ) и ХБП5 до гемодиализа характеризуются его сниженным уровнем в сравнении с условно здоровыми донорами крови, в то время как после гемодиализа, наоборот, регистрируется повышение уровня общего кальция вследствие использования кальций-содержащих фосфат-биндеров и временному перераспределению кальция из костной ткани в кровоток (рис. 1 А). Напротив, при измерении молярной концентрации ионизированного (физиологически активного, не связанного с белками или фосфором) кальция в сыворотке крови было обнаружено его повышение у пациентов с ЦВБ (ХИГМ, ИИ) и ИБС (ХКС, ИМ), а также у пациентов с ХБП5 после гемодиализа в сравнении с условно здоровыми донорами крови по описанным выше причинам (рис. 1 Б).

Наиболее вероятным объяснением повышенного уровня ионизированного кальция у пациентов с ЦВБ и ИБС может быть сниженная концентрация общего белка (рис. 2 А) и кальций-связывающего белка альбумина (рис. 2 Б). Стоит отметить гипопротеинемию и гипоальбуминемию у пациентов с ХБП5 до и ее частичную коррекцию после гемодиализа (рис. 2 Б), что указывает на техническую валидность выполненных измерений.

Молярная концентрация фосфора в сыворотке крови пациентов с ЦВБ и ИБС практически не отличалась от таковой у условно здоровых доноров крови (рис. 3 А). Выявленная гиперфосфатемия у пациентов с ХБП5 до гемодиализа и резкое снижение уровня фосфора в крови после проведения данной процедуры подтвердило техническую валидность выполняемых измерений (рис. 3 А). Измерение концентрации фетуина-А не выявило статистически значимых отличий между группами, практически у всех пациентов его концентрация находилась в пределах физиологической нормы (рис. 3 Б).

Далее была проведена оценка исходной концентрации КФБ в сыворотке крови методом проточной цитометрии с использованием флюоресцентных красителей OsteoSense 680EX и PKH67. Сперва было проведено измерение холостых проб и отрицательного контроля, что позволило оценить фоновую флюоресценцию контрольных образцов и показать отсутствие в них OsteoSense 680EX-положительных PKH67-отрицательных событий до специфического флюоресцентного окрашивания (гейт Q2-UL, рис. 4).

С целью установки напряжения фотоэлектронного умножителя для лазера c длиной волны 638 нм (фильтр 712/25 BP), детектирующего флюоресцентный краситель OsteoSense 680EX, в качестве положительного контроля были использованы искусственно синтезированные КФБ в серии разведений, успешная флюоресцентная детекция которых подтвердила техническую валидность примененного подхода к измерению концентрации КФБ (рис. 5). 

Измерение концентрации КФБ в сыворотке крови пациентов методом проточной цитометрии выявило снижение концентрации КФБ (OsteoSense 680EX-положительных PKH67-отрицательных событий) в крови пациентов с ЦВБ, ИБС и ХБП5 в сравнении с условно здоровыми донорами крови. Медианная концентрация КФБ в сыворотке крови условно здоровых доноров составила 249 КФБ/мкл (межквартильный интервал (МКИ): 162-326), у пациентов с ЦВБ — 170 КФБ/мкл (МКИ: 117-213), у пациентов с ИБС — 139 КФБ/мкл (МКИ: 103-185), у пациентов с ХБП5 до гемодиализа — 203 КФБ/мкл (МКИ: 167-245), у пациентов с ХБП5 после гемодиализа — 193 КФБ/мкл (МКИ: 154-276) (рис. 6). Примеры репрезентативных гейтов (проточно-цитометрических карт) приведены на рисунке 7.

Независимо от течения ишемии, все категории пациентов (пациенты с ЦВБ (ХИГМ и ИИ) и ИБС (ХКС и ИМ)) характеризовались статистически значимо сниженной концентрацией КФБ в сыворотке в сравнении с условно здоровыми донорами крови. Медианная концентрация КФБ в сыворотке крови условно здоровых доноров составила 249 КФБ/мкл (МКИ: 162-326), у пациентов с ХИГМ — 167 КФБ/мкл (МКИ: 105-216), у пациентов с ИИ — 172 КФБ/мкл (МКИ: 118-208), у пациентов с ХКС — 118 КФБ/мкл (МКИ: 85-152), у пациентов с ИМ — 169 КФБ/мкл (МКИ: 128-299) (рис. 8). Примеры репрезентативных гейтов (проточно-цитометрических карт) приведены на рисунке 9.

Обсуждение

Патофизиологическая значимость частиц-скевенджеров избыточного кальция и фосфора (КФБ) достаточно активно привлекает внимание физиологов, кардиологов и нефрологов, поскольку ускоренное формирование данных минерало-органических частиц в крови ассоциировано с развитием артериальной гипертензии, ИМ, ХИГМ, ИИ [7] и сердечно-сосудистой смертью [13] у субъектов без ХБП, а также с развитием заболеваний периферических артерий, ИМ и сердечно-сосудистой смертью у пациентов с ХБП5 (в т.ч. после трансплантации почки) [14]. Кроме того, было продемонстрировано, что ускоренное формирование КФБ в крови коррелирует с тяжестью и прогрессированием кальцификации коронарных артерий, а также развитием острых сердечно-сосудистых событий у пациентов с 2-4 стадиями ХБП [14]. 

Ранее нашей группой было показано, что сыворотка крови пациентов с ЦВБ и ИБС обладает повышенной склонностью к преципитации КФБ при создании сценария искусственного минерального стресса путем ее перенасыщения солевыми растворами кальция (CaCl2) и фосфора (Na2HPO4) в концентрации 2 ммоль/л на фоне сниженной концентрации общего белка и альбумина [12]. Было предположено, что у таких больных истощаются как наиболее мощное первичное депо ионов кальция — альбумин, так и вторичное депо — способность организма формировать КФБ, что в совокупности приводит к избыточности ионизированного кальция, являющегося химическим субстратом для преципитации КФБ при искусственном перенасыщении сыворотки фосфат-анионами.

Прямая проточно-цитометрическая детекция КФБ в сыворотке крови при помощи сочетания флюоресцентных красителей OsteoSense 680EX и PKH67 действительно выявила снижение исходной концентрации КФБ в крови пациентов с ЦВБ (ХИГМ и ИИ), ИБС (ХКС и ИМ) и ХБП5 в сравнении с условно здоровыми донорами крови. На основании этих экспериментов был сделан вывод о том, что сыворотка условно здоровых доноров крови обладает сохранной способностью к компенсации нарушений минерального гомеостаза путем агрегации избыточного кальция и фосфора с белками. Соответственно, сниженное формирование КФБ у пациентов с ССЗ и ХБП5 свидетельствует о нарушенной способности крови агрегировать избыточный кальций и фосфор (вероятно, вследствие сниженного уровня общего белка и альбумина), что также отражается повышенным уровнем ионизированного кальция в крови. Помимо нашей группы, другому научному коллективу также удалось успешно детектировать КФБ в сыворотке крови пациентов с ХБП5 [9]. В этом исследовании было выявлено, что количество КФБ в группе условно здоровых доноров крови составило от 350 до 1400 (медианное значение 1050) КФБ/ мкл, а у пациентов, находящихся на гемодиализе — от 300 до 9000 (медианное значение 1020) КФБ/мкл, а у пациентов, находящихся на перитонеальном диализе — от 400 до 30000 (медианное значение 1090) КФБ/мкл, соответственно [9]. Иные результаты также были получены в другом исследовании этой научной группы, где исходная концентрация КФБ у пациентов с ХБП5 в зависимости от приема кальцимиметика цинакальцета и трансплантации почки варьировала от 16200 КФБ/мкл (после трансплантации) до 32600 (в случае прекращения приема цинакальцета) [10]. Еще одно исследование с подобной методологией у пациентов с ХБП5 выявило исходную концентрацию КФБ в 720-900 частиц/мкл [11]. Существенные различия в показателях можно объяснить тем, что скорость потока для сбора событий (flow rate) в приведенных исследованиях [9-11] была в 5 раз выше (50 мкл/мин), чем в нашем исследовании (10 мкл/мин), что приводит к увеличению количества ложноположительных событий ("засвеченных частиц").

С клинической точки зрения представляет интерес возможность фармакологического воздействия на КФБ с целью их дезинтеграции до момента поглощения эндотелиальными клетками с параллельным выведением избыточных ионов кальция и фосфора из кровотока. Исследование EVOLVE показало, что назначение пациентам с ХБП кальцимиметика цинакальцета приводило к снижению вероятности сердечно-сосудистой смерти и острой сердечной недостаточности [15]. Перспективными подходами для проведения доклинических испытаний способов коррекции нарушений минерального гомеостаза представляются: 1) коррекция концентрации альбумина с "низкой нормальной" до "высокой нормальной"; 2) сапплементация донорами ионов магния, конкурирующими с ионами кальция за связывание с фосфат-анионом; 3) использование соединений с хелатирующим действием, которые позволяют дезинтегрировать уже сформированные КФБ и одновременно вывести высвобождающийся из них кальций и фосфор из кровотока.

Заключение

Проведенное исследование выявило высокую распространенность нарушений кальциевого гомеостаза у пациентов с ССЗ в сравнении с условно здоровым населением. Характерными особенностями таких нарушений у пациентов с ЦВБ и ИБС являются повышение молярной концентрации ионизированного кальция на фоне истощения кальций-связывающих депо (первичного — альбумина и вторичного — КФБ) и нормальном состоянии фосфорного звена минерального гомеостаза.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.