Концентрация липопротеида(а) и содержание интерферон γ-продуцирующих Т-хелперов 17 (Тх17/1) в крови мужчин с преждевременной манифестацией ишемической болезни сердца в анамнезе

Атеросклероз представляет собой хроническое воспалительное заболевание артерий, развивающееся вследствие инфильтрации атерогенными липопротеидами субэндотелиального слоя сосудистой стенки, и является причиной сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), таких как ишемическая болезнь сердца (ИБС), нарушение мозгового кровообращения, заболевания периферических артерий.

Нарушения липидного обмена или дислипидемии являются основной причиной развития атеросклероза. Повышенный уровень в кровотоке липопротеида(а) (Лп(а)) встречается примерно у 20% населения и ассоциирован с атеросклеротическими ССЗ и остаточным риском сердечно-сосудистых осложнений [1]. Гиперлипопротеидемия(а) вносит непосредственный вклад в погрешность измерений параметров липидного профиля и является частой причиной ошибочной постановки диагноза семейной гиперхолестеринемии [2]. Нарушения липидного спектра крови могут сопровождаться изменениями в составе циркулирующих иммунных клеток. Так, у больных с гиперлипопротеидемией(а) и стенозирующим трехсосудистым поражением коронарных артерий было показано увеличение содержания в крови провоспалительных CD16+ моноцитов [3].

Согласно современным представлениям, атеросклероз является следствием хронического воспалительного процесса, индуцированного накоплением атерогенных липопротеидов в артериальной стенке и активацией иммунных клеток. Различные популяции CD4+ Т-лимфоцитов играют неоднозначную роль в атерогенезе. Т-хелперы 1 типа (Тх1) продуцируют провоспалительные цитокины (интерферон (ИНФ)γ, фактор некроза опухоли, лимфотоксин, интерлейкины -2, -12, -18) и т.о. способствуют прогрессированию атеросклероза [4]. Регуляторные Т-клетки (Трег) подавляют избыточный иммуновоспалительный ответ, их протективная роль при ССЗ подтверждена многочисленными исследованиями [5]. В последние годы активное внимание уделяется изучению вклада Т-хелперов (Тх) 17 в патогенез атеросклероза. Продуцируемый ими интерлейкин-17 способен активировать клетки неспецифического иммунитета [6], прежде всего, нейтрофильные гранулоциты. Ранее нами была показана взаимосвязь повышенного количества Тх17 и увеличение соотношения Тх17/Трег у пациентов с тяжелым атеросклеротическим поражением коронарных и сонных артерий [7-9]. Субпопуляция ИНФγ-продуцирующих Т-хелперов 17 (Тх17/1) обладает наиболее выраженным провоспалительным потенциалом, т.к. дополнительно продуцируемый ими ИНФγ является мощным активатором моноцитов/макрофагов [6]. Доказан вклад Тх17/1 в патогенез аутоиммунных заболеваний [10-12]; при атеросклерозе данная популяция не изучалась.

В настоящем исследовании мы проанализировали взаимосвязь раннего развития ИБС с концентрацией Лп(а), показателями липидного спектра и содержанием субпопуляций Т-лимфоцитов с про- и противовоспалительными свойствами.

Материал и методы

В ретроспективное одномоментное исследование было включено 76 мужчин в возрасте от 40 до 79 лет, наблюдавшихся или обратившихся в НМИЦК им. акад. Е. И. Чазова. Группу исследования составили пациенты со стенозирующим коронарным атеросклерозом и преждевременной (до 55 лет) манифестацией ИБС в анамнезе (n=56). В данную группу включались пациенты при соблюдении следующих условий: выявленное по данным первичной коронарной ангиографии стенозирование в одной или нескольких коронарных артериях ≥50%, верифицированная при нагрузочном тестировании ишемия миокарда или наличие в анамнезе данных о реваскуляризации миокарда или перенесённом инфаркте миокарда, подтвержденного документально. Контрольную группу составили пациенты без ИБС и стенозирующего атеросклероза коронарных и периферических артерий (n=20).

Исследование было выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской Декларации. Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом ФГБУ “НМИЦК им. акад. Е.И. Чазова” Минздрава России (протокол № 251 от 25.11.2019). Все включенные пациенты дали письменное согласие на участие в исследовании.

Критериями исключения являлись: острый коронарный синдром, инфекционно-воспалительные заболевания в предшествующие 3 мес.; хроническая сердечная недостаточность III-IV функционального класса; системные заболевания соединительной ткани; хроническая болезнь почек IV или V стадии; выраженная дисфункция щитовидной железы (тиреотропный гормон в 2 раза ниже нижней границы нормы или в 2 раза выше верхней границы нормы); острый гепатит, цирроз печени; терапия, влияющая на уровень Лп(а) (аферез, никотиновая кислота, ингибиторы PCSK9, глюкокортикоиды, половые гормоны).

На момент включения в исследование все пациенты получали рекомендованную для больных атеросклерозом терапию: бета-блокаторы, аспирин/клопидогрел, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента/сартаны).

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием флуоресцентно меченных антител к антигенам CD45, CD3, CD4, Foxp3, INFγ, IL17 и наборов для фиксации/пермеабилизации клеток, в соответствии с инструкциями производителей (“Thermo Fisher Scientific”, “R&DSystems”, “BD Immunocytometry Systems”, США). Мононуклеарные лейкоциты получали путем центрифугирования образцов крови в градиенте плотности фиколл-верографин (1,077 г/см3) и активировали в культуре в присутствии форболмиристатацетата, иономицина и брефельдина А (“Sigma-Aldrich”, США). Клетки последовательно окрашивали антителами к поверхностным и внутриклеточным белкам после фиксации и пермеабилизации. Связывание антител оценивали методом проточной цитометрии на приборах FACS Сalibur и FACS Canto (“BD Immunocytometry Systems”, США). Лимфоциты выделяли по параметрам светорассеяния и экспрессии CD45. Определялись следующие показатели клеточного иммунитета: количество Т-лимфоцитов, хелперных CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, CD4+INFγ+ Тх1, CD4+Foxp3+ регуляторных Т-клеток, CD4+IL17+ Тх17, CD4+IL17+INFγ+ Тх17/1.

Концентрацию общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛВП) определяли в сыворотке крови всех пациентов ферментативным колориметрическим методом на анализаторе Architect C-8000 (Abbott, США). Концентрацию холестерина всех фракций атерогенных липопротеидов (ХС неЛВП) рассчитывали по формуле ХС неЛВП = ОХС — ХС ЛВП; холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛНП) рассчитывали по формуле МартинаХопкинса: ХС ЛНП = ХС неЛВП — ТГ/f, где f — коэффициент соотношения ТГ/ХС ЛОНП. При расчете концентрации ХС ЛНП, корригированного по уровню ХС, входящего в состав Лп(а), использовали модификацию Далена ХС ЛНПкорр = ХС ЛНП — Лп(а) × 0,3/38,7. В сыворотке крови всех пациентов измеряли концентрацию Лп(а) методом иммуноферментного анализа с использованием моноспецифических поликлональных антител барана против Лп(а) человека.

Статистический анализ данных. Ввиду небольшого объема выборки и отсутствия нормального распределения для большинства исследованных показателей применяли непараметрические методы анализа. Данные представлены как медиана (25-й процентиль; 75-й процентиль). Для сопоставления групп по качественным признакам использовали двусторонний критерий Фишера. Для анализа взаимосвязи исследуемых параметров использовали метод Спирмена. Пороговые значения Лп(а) и показателей клеточного иммунитета в отношении предсказания ранней манифестации ИБС, определение их чувствительности и специфичности получены при построении кривых операционных характеристик (ROC-анализ). Логистический регрессионный анализ выполняли для выявления взаимосвязи между изучаемыми показателями с ранней манифестацией ИБС. При создании модели также учитывалось отсутствие внутренних корреляционных связей между оцениваемыми параметрами. Различия считались статистически достоверными при р<0,05.

Результаты

Клинико-лабораторная и иммунологическая характеристика пациентов представлена в таблице 1. Группы пациентов были сопоставимы по возрасту, индексу массы тела, наличию у них артериальной гипертензии и сахарного диабета. Пациенты с преждевременной манифестацией ИБС в анамнезе чаще принимали статины. Концентрация глюкозы в крови у пациентов данной группы была выше, а содержание ОХС, ХС ЛВП и ХС ЛНПкорр ниже, по сравнению с контролем. Медиана концентрации Лп(а) в группе мужчин с преждевременным развитием ИБС в анамнезе четырехкратно превышала этот показатель в контрольной группе.

Относительное содержание Тх17/1 было выше в группе ИБС по сравнению с контролем. По другим исследованным иммунологическим параметрам, количество CD3+CD4+ Т-хелперов, Тх1, Тх17 и Трег, группы не различались.

Концентрация Лп(а) >35 мг/дл с чувствительностью 61% и специфичностью 80%, также как и содержание Тх17/1 >14% от Тх17 с чувствительностью 80% и специфичностью 55%, ассоциировались с ранней манифестацией ИБС в анамнезе согласно результатам проведенного ROC-анализа (рис. 1). Согласно последним евразийским рекомендациям 2020г концентрация Лп(а) 30 мг/дл принята за границу нормы у больных высокого и очень высокого риска. Концентрация Лп(а) ≥30 мг/дл ассоциировалась с наличием ранней ИБС в анамнезе с чувствительностью 61% и  специфичностью 75% и  была использована при дальнейшем анализе.

У пациентов с  концентрацией холестерина атерогенных липопротеидов ниже медианы,  — ХС ЛНПкорр <2 ммоль/л и ХС неЛВП <3,2 ммоль/л, — количество Тх17/1 ассоциировалось с наличием ранней манифестации ИБС в  анамнезе (r=0,33 р=0,03 и  r=0,41, р=0,01, соответственно), в  то время как у  пациентов с  уровнем ХС ЛНПкорр >2  ммоль/л или ХС неЛВП >3  ммоль/л данная взаимосвязь была менее выраженной и  статистически не значимой (r=0,21, р=0,24 и r=0,11, р=0,11, соответственно).

Концентрация Лп(а) ≥30  мг/дл (отношение шансов (ОШ) 5,0 при 95% доверительном интервале (ДИ) 1,59-15,75, р=0,006), также как относительное содержание Тх17/1 >14% (ОШ 5,0 при 95% ДИ 1,66-15,02, р=0,004) ассоциируется с  наличием преждевременной манифестации ИБС в анамнезе в общей когорте пациентов. Сочетание повышенной концентрации Лп(а) на фоне повышенного содержания Тх17/1 ассоциировалось с многократным увеличением шансов преждевременной манифестации ИБС в  анамнезе (ОШ 28,0 при 95% ДИ 4,31-181,75, р=0,0005) (рис. 2).

Увеличение концентрации Лп(а) на 10 мг/дл и содержания Тх17/1 (% от Тх17) на 1% в  крови ассоциировалось с  возрастанием шансов наличия в  анамнезе преждевременного развития атеросклероза на 19% (ОШ 1,19 (95% ДИ 1,01-1,39) и на 13% (ОШ 1,13 (95% ДИ 1,03-1,24), соответственно, вне зависимости от возраста и уровня ХС неЛВП. При проведении логистического регрессионного анализа с введением в  модель возраста, наличия у  пациентов артериальной гипертензии, сахарного диабета, ожирения, приема статинов, и ХС неЛВП, повышенная концентрация Лп(а) (≥30 мг/дл) и содержание Тх17/1 (>14% от Тх17) оставались независимыми факторами, ассоциированными со значимым повышением шансов ранней манифестации ИБС в  анамнезе (ОШ 4,6 (95% ДИ 1,1-20,2) и  10,9 (2,1-56,7), р<0,05, соответственно), площадь под кривой составила 0,93, что свидетельствовало об очень хорошем качестве модели.

Обсуждение

В одномоментном ретроспективном исследовании мы изучили взаимосвязь повышенной концентрации Лп(а), нерутинных показателей липидного спектра, таких как ХС неЛВП и ХС ЛНПкорр, а также различных субпопуляций CD4+ Т-лимфоцитов с преждевременным развитием ИБС в анамнезе. Для исключения возможного влияния половых различий на проанализированные показатели в настоящее исследование включались только мужчины. В опытную группу были включены пациенты с  преждевременной манифестацией ИБС в  анамнезе, в  контрольную — сопоставимые по возрасту пациенты без ИБС и стенозирующего атеросклероза в коронарных и периферических артериях.

У пациентов с преждевременным развитием ИБС в  анамнезе концентрация ОХС была ниже, а  концентрация глюкозы выше (при сопоставимости групп по частоте встречаемости сахарного диабета II типа). Выявленные различия между группами, по-видимому, обусловлены неодинаковой частотой приема статинов [13]. У  мужчин с  ранней ИБС в анамнезе нами была обнаружена тенденция к снижению уровня циркулирующих Тх1, что может быть обусловлено противовоспалительным эффектом статинов, связанным с подавлением пролиферации эффекторных лимфоцитов [14].

Мы обнаружили более высокий уровень ИНФγпродуцирующих лимфоцитов среди Тх17 в группе пациентов с ранней манифестацией ИБС, данный показатель обладал высокой чувствительностью и умеренной специфичностью. Следует отметить, что обнаруженная нами взаимосвязь содержания Тх17/1 с  ранним развитием ИБС проявлялась преимущественно у  больных на фоне уровня ХС ЛНПкорр <2  ммоль/л и  ХС неЛВП <3,2  ммоль/л. Описанные закономерности совпадают с  ранее представленными нами данными о наибольшем вкладе Тх17 и Трег/ Тх17 в прогрессирование атеросклероза сонных артерий на фоне снижения уровня ХС ЛНП ниже медианы 3,5 ммоль/л [8].

Субпопуляция Т-клеток, способных к  синтезу свойственных для Тх17 и Тх1 цитокинов, была описана недавно и сразу привлекла внимание исследователей как потенциальный триггер иммунных реакций при хронических воспалительных и  аутоиммунных заболеваниях. Тх17/1, как и  Тх17 и  Тх1, обнаружены в спинномозговой жидкости пациентов с рецидивирующим рассеянным склерозом, выявлено расширение этих популяций лимфоцитов в периферической крови пациентов с иммунной тромбоцитопенией [10][12]. В  легочных лаважах пациентов с  саркоидозом продемонстрировано увеличение относительного количества Тх17/1, при этом различий в содержании Тх17 и Тх1 не было выявлено [11]. Можно предположить, что Тх17/1 обладают особыми свойствами по сравнению с другими популяциями эффекторных Т-клеток.

Повышенный уровень Лп(а) является фактором риска (ФР) развития атеросклеротических ССЗ. Согласно нашим результатам, концентрация Лп(а) была значительно выше в  группе мужчин с  преждевременным развитием ИБС в  анамнезе независимо от других ФР, что согласуется с  имеющимися литературными данными [15]. Несмотря на многочисленные исследования, механизм высокой атерогенности Лп(а) не до конца понятен, а  его влияние как на показатель ХС ЛНП, так и на риски развития ССЗ, недооценивается не только в  России, но и  за рубежом. Полученные нами результаты наглядно показывают, что Лп(а) является независимым ФР раннего развития ИБС, и  подтверждает необходимость измерения концентрации Лп(а) у  каждого пациента хотя бы один раз для оценки жизненного риска, как это было сформулировано в  последних Российских рекомендациях Евразийской ассоциации кардиологов и  Национального общества по изучению атеросклероза для “диагностики и  коррекции нарушений липидного обмена с  целью профилактики и  лечения атеросклероза” 2020г. Потенцирующая взаимосвязь между Лп(а) и  минорными субпопуляциями Т-клеток была обнаружена нами ранее — сочетание даже незначительно повышенной концентрации Лп(а) >12,8  мг/дл и  Тх17 >11,4 тыс./мл значительно увеличивало шансы тяжелого поражения коронарных артерий [16]. Результаты данной работы свидетельствуют о  независимом и  потенцирующем друг друга влиянии на преждевременное развитие ИБС сдвигов в  субпопуляционном составе Т-лимфоцитов и концентрации Лп(а), вне зависимости от концентрации других атерогенных липопротеидов, оцениваемых по ХС неЛВП.

Несмотря на накопление знаний о  механизмах развития атеросклероза и расширение возможностей терапии, стабилизировать состояние пациентов удается далеко не всегда. Остаточный (резидуальный) риск сердечно-сосудистых осложнений остается достаточно высоким, несмотря на достижение целевых показателей известных ФР. В силу особенности своей структуры Лп(а) может реализовывать свою “провоспалительную” составляющую через воздействие на иммунные клетки, включая лимфоциты, моноциты и  нейтрофилы, а  также эндотелиальные клетки, инициируя или поддерживая воспалительный процесс в стенке сосуда. Исследование таких “дополнительных” патогенетических механизмов атеросклероза, связывающих различные формы нарушений липидного обмена и иммунные механизмы, является перспективной задачей современных клинических исследований.

Ограничения исследования. Среди ограничений данного исследования можно выделить малое количество пациентов; несопоставимость пациентов по частоте приема статинов как препаратов с доказанными иммунотропными свойствами, что могло повлиять на представленные в  данной работе параметры.

Заключение

Впервые показано, что повышенная концентрация Лп(а) на фоне увеличенного содержания Тх17/1 связана с преждевременным развитием стенозирующего атеросклероза коронарных артерий и ранней манифестацией ИБС у мужчин.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено в рамках темы НИР № 121031300186- 2 “Атерогенные липопротеиды и их комплексы с биологически-активными компонентами плазмы крови при прогрессировании атеросклероза” (формирование групп пациентов, определение концентрации Лп(а), липидного спектра) и при поддержке гранта РНФ № 22-25-00051 “Вклад нейтрофильных гранулоцитов в прогрессирование атеросклероза; участие атерогенных липопротеидов в активации клеток” (определение показателей клеточного иммунитета).