Новые аспекты влияния факторов иммунитета и микробиома на реакции отторжения трансплантированного сердца

Благодаря достигнутым успехам в вопросах трансплантации сердца (ТС) и возможностям современной иммуносупрессивной терапии, медиана выживаемости у взрослых пациентов составляет 14 лет. Вместе с тем, очевидно, что требуется дальнейшее совершенствование методов лечения с целью улучшения долгосрочных эффектов трансплантации. Основной причиной смерти и худшего прогноза являются инфекции, развитие хронического и кризы острого отторжения трансплантата [1].

Имеющиеся в настоящее время методы диагностики реакций отторжения трансплантата основаны на детекции уже запущенного процесса с наличием необратимых морфологических изменений. Кроме того, даже для констатации таких изменений требуется проведение инвазивной процедуры — биопсии тканей трансплантированного сердца [2]. Таким образом, уже сейчас имеется острая потребность в неинвазивных методиках диагностики развития реакций отторжения трансплантата, которые позволили бы продлить сроки функционирования трансплантированного органа, а значит, увеличить продолжительность жизни и повысить качество жизни реципиентов.

Вклад микробиоты в развитие воспаления, созревание и поляризацию Т-клеток

Установлено, что микробное сообщество играет важную роль в поддержании местного гомеостаза, модулирует активацию и дифференцировку некоторых популяций лимфоцитов, в т.ч. Т-хелперов (Th), выработку иммуноглобулина А и антимикробных пептидов, способствует развитию лимфоидных структур, влияет на свойства слизистого слоя желудочно-кишечного тракта, физиологию и метаболизм хозяина [3]. Микрофлора кишечника условно здоровых индивидуумов обычно состоит из различных представителей Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusobacteria, Proteobacteria и Verrucomicrobia [4]. В пределах тонкого кишечника преобладают Enterobacteriaceae и Lactobacillaceae, тогда как в толстой кишке содержатся представители Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Prevotellaceae, Rikenellaceae и Ruminococcaceae.

При изучении влияния нормального состава микробиоты кишечника на факторы адаптивного иммунитета было установлено, что состав микробиоты может быть тесно связан с субпопуляционным составом циркулирующих в крови Th [3]. Кластеризация микробиоты кишечника условно здоровых добровольцев выявила три энтеротипа: в первом энтеротипе доминировали бактерии рода Bacteroides, во втором — Prevotella, третий энтеротип отличался от первых двух большим разнообразием на основе индекса Shannon и тенденцией к доминированию представителей семейства Ruminococcaceae [3]. У добровольцев с кишечным энтеротипом 3 (доминирование Ruminococcaceae) отмечалось значительное снижение уровня циркулирующих Th17 и Th22 клеток, тогда как у лиц с кишечным энтеротипом 1 (доминирование Bacteroides) наблюдалось увеличение уровня Th17.1 клеток [3]. В in vivo исследованиях, проведенных на гнотобиотических мышах, было показано, что только некоторые комменсальные бактерии, например, сегментированные нитчатые (филаментные) бактерии (SFB, от англ. “segmented filamentous bacteria”, некультивируемые Clostridia-related species), могут модулировать Т-клеточный ответ слизистых оболочек у иммунокомпетентных мышей, индуцируя дифференцировку Th0 в сторону Th17, или Th1, Th2 [5]; дифференцировку популяции CD4+ Т-клеток, синтезирующих во время воспаления кишечника провоспалительный цитокин интерлейкин (IL)-22, который играет важную роль во взаимодействии между клетками иммунной системы и клетками в некоторых тканях, регулируя регенерацию тканей и противомикробный иммунитет [6]; а также активировать постнатальное развитие изолированных лимфоидных фолликулов и третичной лимфоидной ткани, которые заменяли Пейеровы бляшки при формировании SFB-специфичных Th17 клеток у мышей [7].

Эксперименты in vivo на мышах, сенсибилизированных к овальбумину, продемонстрировали, что пероральное введение животным Bifidobacteria сопровождалось снижением количества Th2 клеток на фоне увеличения регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) и клеток, синтезирующих противовоспалительный цитокин IL-10, как на системном уровне (в селезенке), так и локально (в клетках, инфильтрирующих подслизистую кишечника), улучшая нарушенную функцию эпителиального барьера [8]. Еще одним механизмом, связанным с подавлением дифференцировки эффекторных Th клеток (особенно Th1 и Th2) и снижением уровня синтезируемых ими провоспалительных цитокинов, может служить активация аденозиновых А2А рецепторов бактериями Lactobacillus reuteri [9]. Ремоделирование микробиоты у SF (от англ. “scurfy”) мышей, несущих мутацию в гене Foxp3, с помощью пробиотика Lactobacillus reuteri повысило выживаемость и уменьшило полиорганное воспаление у мышей SF, т.к. Lactobacillus reuteri меняло метаболомный профиль, нарушенный дефицитом регуляторных Т-лимфоцитов, в результате чего наблюдалось восстановление уровня пуринового метаболита инозина, обладающего иммуномодулирующим действием на клетки иммунной системы [9].

Особый интерес в качестве факторов, регулирующих реакции воспаления, представляют представители комменсальной микробиоты человека, которые потенциально способны к транслокации и могут вызывать патологические процессы при ослаблении иммунитета. Например, проникновение Bacteroides fragilis через базальную мембрану эпителиоцитов сопровождается активацией воспалительных процессов, тогда как его локализация в просвете кишки способствует дифференцировке и активации Тreg, приводящих к снижению воспалительных реакций на слизистых [10]. Показано, что взаимодействие именно полисахарида А (PSA) Bacteroides fragilis с TOLL-подобным рецептором 2 типа (TLR2) активирует противовоспалительную функцию Foxр3(+) Тreg, способствуя формированию иммунологической толерантности к собственной микробиоте кишечника и поддержанию гомеостаза, тогда как Bacteroides fragilis, лишенные PSA, вызывают преимущественное формирование Th17 клеток и развитие воспалительного ответа у мышей [11]. На модели экспериментального колита, вызванного введением лабораторным животным Helicobacter hepaticus, было показано, что применение как Bacteroides fragilis, так и очищенного полисахарида А, обеспечивало выраженный протективный эффект, связанный со снижением продукции провоспалительного цитокина IL17, а также формированием IL-10-синтезирующих CD4+ Т-лимфоцитов [12].

Одним из важнейших противовоспалительных действий комменсальной микробиоты кишечника является подавление продукции ключевых провоспалительных цитокинов, таких как IL-17 и IL-23, а также IL-1β и IL-6. Так, в трехмерной культуральной модели (3D coculture model composed of human intestinal HT-29/B6 or T84 cells and PBMCs) было показано, что Bifidobacterium breve обладают противовоспалительным действием в кишечнике, подавляя экспрессию провоспалительных цитокинов IL-17, IL-23, CD40, за счет подавления ацетилирования гистонов и повышения метилирования ДНК, что, в свою очередь, приводит к ограничению активации транскрипции, опосредованной NF-κB [13]. Введение L. acidophilus мышам, у которых было индуцировано развитие колита с использованием 1,5% натрия декстран сульфата (DSS), подавляло опосредованную клетками Th17 секрецию провоспалительного цитокина IL-17 за счет подавления экспрессии IL-23 и трансформирующего фактора роста-β1, которые играют важную роль в дифференцировке Th17 клеток, и последующего фосфорилирования p-STAT3 [14]. При введении мышам с индуцированным колитом пробиотика, содержащего семь различных видов комменсальных бактерий (бифидобактерий, лактобактерий и S. thermophilus) было отмечено выраженное снижение уровня воспаления в кишечнике за счет снижения продукции провоспалительного цитокина IL-6 [15].

Изменения в составе микробиоты кишечника могут быть связаны с развитием различных патологических состояний в разных органах и тканях, в т.ч. иммуноопосредованных заболеваний. У пациентов с впервые диагностированным ревматоидным артритом, которые еще не получали какой-либо терапии, в просвете кишки содержание бактерий рода Prevotella было увеличено относительно контрольной группы, тогда как Bacteroides были достоверно ниже. При этом установлена статистически достоверная корреляция между присутствием вида Prevotella copri и наличием ревматоидного артрита (обнаружены у 75% пациентов с ревматоидным артритом по сравнению с 21% в группе контроля) [16]. Немаловажен и тот факт, что на мышиной модели коллаген-индуцированного артрита показано, что комплексное применение пробиотиков (совместно с солями цинка и коэнзима Q10) на организменном уровне сопровождалось снижением уровней воспаления суставов, а также замедлением процессов разрушения костей и повреждения хрящевой ткани, более того, у животных наблюдалось снижение экспрессии провоспалительных цитокинов: фактор некроза опухоли (TNF)-α, IL-1β, IL-6 и IL-17 на фоне уменьшения процентного содержания Th17 и повышения уровня Treg клеток [17].

Микробиота кишечника у пациентов с хронической сердечной недостаточностью

Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) приводит к мультисистемным изменениям, в частности, энтеропатии, при которой изменяется морфология эпителия кишечника, а также проницаемость и абсорбция [18]. Повышенная адгезия условно-патогенных бактерий к эпителию кишечника и увеличение бактериальной пленки может вызвать рост уровня экспрессии провоспалительных цитокинов, нарушение целостности эпителиального барьера и, как следствие, проникновение микробных метаболитов или самих бактерий в системный кровоток, обусловливая развитие хронического воспаления, что, в свою очередь, является потенциальным фактором прогрессирования сердечной недостаточности [18].

Для пациентов с ХСН III-IV функционального класса (ФК) характерно уменьшение β-разнообразия микробиоты толстой кишки, более высокий уровень эндотоксемии, системного воспаления и окислительного стресса по сравнению с пациентами с ХСН I-II ФК [19]. У всех пациентов с ХСН независимо от ФК отмечалось заметное истощение филотипа Bacteroidetes, однако никаких различий в относительной численности филотипов между категориями пациентов не наблюдалось [19]. В другом исследовании у больных со сниженной фракцией выброса из-за ишемической или дилатационной кардиомиопатии снижение бактериального разнообразия было вызвано значительным истощением бактериальных родов Blautia и Collinsella, а также уменьшением количества представителей рода Faecalibacterium, продуцирующих бутират, который является основным источником энергии для эпителиальных клеток кишечника [20]. Поскольку превалирование рода Collinsella ранее было ассоциировано с сахарным диабетом 2 типа и атеросклерозом, авторы предполагают, что истощение данного рода может быть характерным именно для пациентов с сердечной недостаточностью. В свою очередь, отдельное внимание привлекают комменсальные бактерии рода Blautia, которые могут опосредовать противовоспалительные механизмы, их доминирование в составе кишечной микробиоты пациентов после аллогенной трансплантации костного мозга было ассоциировано с уменьшением смертности и улучшением общей выживаемости при развитии реакций “трансплантат против хозяина” [21].

Вклад микробиоты в развитие реакций отторжения трансплантированного сердца

В последние годы все больше внимания уделяется изучению факторов микробиоты, потенциально вовлеченных в развитие реакций “трансплантат против хозяина” после трансплантации печени, почек, тонкой кишки, трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, при этом исследования в области ТС единичны.

В экспериментах на мышиной модели по ТС было показано, что микробиом кишечника влияет на выживаемость сердечного аллотрансплантата посредством модуляции врожденной и адаптивной иммунной системы [22]. В частности, введение фекальной микробиоты, обогащённой Bifidobacterium pseudolongum, мышам после ТС было связано с более длительным сроком жизни аллотрансплантата сердца и меньшим воспалением и фиброзом, в то время как введение фекальной нормальной микробиоты мышей или фекальной микробиоты мышей с колитом приводило к худшей выживаемости и ухудшению гистологического состояния аллотрансплантата сердца. Кроме того, стимуляция дендритных (JAWSII DC) и макрофагальных (RAW264.7) клеточных линий Bifidobacterium pseudolongum индуцировала продукцию противовоспалительного цитокина IL-10 и гомеостатического хемокина CCL19, и значительно в меньшем количестве провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-6, тогда как липополисахариды и бактерия Desulfovibrio desulfuricans, доминирующая в составе микробиоты мышей с колитом, индуцировали более воспалительный цитокиновый ответ [22]. Дальнейший анализ выявил диаметральное влияние Bifidobacterium pseudolongum и Desulfovibrio desulfuricans на структуру кортикального слоя лимфатического узла: B. pseudolongum индуцировала соотношение ламинина α4/α5 кортикального слоя, ассоциированное с подавлением и толерантностью, в то время как D. desulfuricans индуцировала соотношение ламининов α4/α5, связанное с воспалением и отторжением аллотрансплантата. Таким образом, очевидно, что популяционный состав микробиоты может значимо влиять на развитие реакций отторжения аллотрансплантата и аллоиммунитет посредством широкого воздействия на местном, региональном и системном уровнях на факторы врожденного и адаптивного иммунитета [22].

Несмотря на восстановление физического и социального функционирования пациентов после ТС, у больных наблюдается лишь незначительная динамика восстановления состава микробиоты кишечника и уменьшения маркеров системного воспаления (С-реактивный белок, IL-6, TNF-α и адипонектин эндотелин-1) и окислительного стресса (изопростан), при этом биомаркеры эндотоксемии (липополисахарид и растворимый sCD14) сохраняются на прежнем уровне [19]. Отмечается, что накопление в плазме крови пациентов после ТС метаболита γ-бутиробетаина, метаболизм которого частично опосредован микробиотой кишечника (microbiotadependent carnitine-γ-butyrobetaine-trimethylamine N-oxide pathway), ассоциировано с более высокой частотой кризов острого отторжения и увеличением общего объема атеромы коронарных артерий пересаженного сердца [23].

Таким образом, мониторинг состава микробиома кишечника в перитрансплантационном периоде может являться потенциально важным суррогатным маркером отсроченных осложнений после трансплантации, а воздействие на микробиом может помочь достичь лучших результатов в повышении выживаемости реципиентов [24]. В настоящее время недостаточно данных о дополнительных факторах, влияющих на микробиоту и изменение иммунологического статуса пациента при проспективном наблюдении до и после операции с параллельной оценкой таких факторов, как возраст, вес, образ жизни и диета реципиента.

Влияние факторов иммунитета на реакции отторжения трансплантатов

Распознавание аллографта иммунной системой реципиента, равно как и последующие реакции отторжения трансплантата, являются ключевыми аспектами для изучения современной трансплантологией, т.к. открывают перспективы терапии угрожающих состояний у этой категории пациентов. Отторжение трансплантата опосредуется Т-лимфоцитами во вторичных органах иммунной системы реципиента. Там же происходит распознавание молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC, от англ. “major histocompatibility complex”). Распознавание аллоантигенов Т-клетками может происходить прямым и непрямым путями [25]. При прямом распознавании Т-клетки взаимодействуют с аллогенными MHC белками, присутствующими на поверхности донорских клеток [25]. Непрямой путь опосредуется Т-клетками, распознающими пептиды, полученные от донорских MHC и малых антигенов, которые процессированы и представлены в ассоциации с собственными MHC молекулами антиген-презентирующими клетками реципиента [2][25]. Активации Т-лимфоцитов приписывается дальнейшая миграция донорских антигенов от профессиональных антиген-презентирующих клеток к лимфоидным тканям реципиента и непосредственно коммуникация последних с эффекторными Т-лимфоцитами [26]. В то время как прямой путь является движущей силой острой реакции отторжения аллографта, непрямая Т-клеточная аллореактивность приводит к продукции аллоантител и хронической реакции отторжения, ассоциированной с васкулопатией трансплантата и фиброзом тканей [27][28]. Таким образом, как в случае острой реакции, так и в случае хронического отторжения аллотрансплантата, пусковым является презентация антигена Т-клеткам.

В настоящее время активно изучается роль субпопуляций Th, включая Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, субпопуляции фолликулярных Th и Treg, которые взаимно регулируют друг друга, в реакциях отторжения трансплантатов.

Предполагается, что активированные Th2 клетки, которые являются функциональными “антагонистами” Th1 и способны снижать эффективность поляризации Th0 в сторону Th1, могут подавлять реакции острого отторжения трансплантата, но могут при этом принимать активное участие в реакциях хронического отторжения [29]. В экспериментах на мышах было показано, что стимуляции ответа, опосредованного Th2 клетками, блокировала формирование CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов и заметно замедляла отторжение кожных аллотрансплантатов, но вызывала de novo хроническое отторжение трансплантатов сердца [30].

В ряде работ на экспериментальных мышиных моделях in vivo было показано, что Th17 клетки играют важную роль в процессах отторжения тканей сердца. Так, блокада IL-17 при помощи терапевтических антител на модели аллотрансплантации сердца у мышей сопровождалась продлением сроков выживаемости трансплантата, что указывало на важную роль данного цитокина, а также клеток-продуцентов в развитии реакций отторжения [31]. Введение лабораторным животным галектина-9, обладающего цитотоксическим действием по отношению Th1 и Th17 клеткам, способствовало увеличению выживаемости аллогенного сердечного трансплантата у мышей [32]. Более того, указанный способ терапии приводил к снижению экспрессии матричной РНК (мРНК) IFNγ и IL-17, а также снижал содержание Th1 и Th17 клеток в периферической крови и региональных лимфатических узлах. Прямые указания на то, что Th17 способны вызывать отторжение сердечного аллотрансплантата, были получены в экспериментах на мышах, лишенных специфического для Th1 фактора транскрипции T-bet [33]. После пересадки несоответствующих по MHC II васкуляризированных сердечных аллотрансплантатов у этих мышей скорость отторжения трансплантата превышала значения, полученные для группы мышей дикого типа. Более того, гистологические исследования выявили явные признаки васкулопатии, увеличение количества лимфоцитов и нейтрофилов, экспрессирующих IL17, тогда как блокада IL-17 привела к значительному увеличению выживаемости аллотрансплантата [33].

На модели мышиного гетеротопического трансплантата сердца у мышей-реципиентов, дефицитных по IL-17, наблюдались пониженная инфильтрация воспалительными клетками ткани аллотрансплантата, а также уменьшение продукции провоспалительных IL-6 и MCP-1 и, наконец, снижение выраженности признаков болезни коронарных артерий пересаженного сердца [34]. На экспериментальной модели шейной гетеротопической ТС у мышей было показано, что у мышей-реципиентов, получавших сиртинол, были более низкие уровни экспрессии IL-17A и более высокие уровни экспрессии Foxp3 [35]. В ходе экспериментов in vivo сиртинол снижал содержание Th17-клеток и увеличивал долю Treg, а также время выживаемости трансплантата. Еще одним подтверждением важнейшей роли Th17 клеток в реакциях отторжения трансплантатов сердца является эффективность применения ингибиторов сигнального пути JAK2/STAT3, которые задействованы в формировании пула Th17 клеток [36]. Так, применение ингибиторов JAK2/STAT3 сопровождалось снижением уровней мРНК транскрипционного фактора RORγt, а также ключевых цитокинов IL-17, IL-6 и TNF-β, равно как и увеличением сроков выживаемости трансплантатов сердца.

Фолликулярные Th, отвечающие за регуляцию специфического гуморального иммунного ответа, также могут принимать непосредственное участие в формировании различных механизмов отторжения трансплантата [37]. Так, у пациентов во время острого отторжения трансплантата сердца были выявлены высокие уровни экспрессии мРНК, IL-21 и α-цепи рецептора для IL-21 внутри трансплантата по сравнению с реципиентами без отторжения [31]. С применением экспериментальных моделей in vivo было показано, что IL-21 играет важную роль при развитии хронической васкулопатии сердечного аллотрансплантата, а также важен для протекания острого и ускоренного отторжения кожных и сердечных аллотрансплантатов [38]. Более того, блокада передачи сигнала от IL-21 при помощи IL-21R-Fc предотвращала развитие васкулопатии сердечного аллотрансплантата у мышей дикого типа, что указывает на высокий терапевтический потенциал как самого цитокина, так и фолликулярных Th клеток, способных к его продукции.

Микровезикулы как потенциальный фактор активации хронического отторжения трансплантата

В последние годы было установлено, что отторжение аллографта зависит от переноса внеклеточных везикул (ВВ) от клеток донорского органа, несущих MHC, к антигенпрезентирующим клеткам реципиента, что приводит к запуску иммунных реакций отторжения [39][40]. Активация Т-клеток посредством экзосом происходит схожим образом [41][42]. В настоящее время есть представление о том, что перенос донорских молекул MHC ВВ является ключевым элементом формирования Т-клеточного ответа на интактные донорские белки MHC, приводящего к острой реакции отторжения аллотрансплантата [43].

Вместе с тем, ВВ могут быть факторами развития толерантности к имплантированному аллотрансплантату. Предполагается, что ВВ действуют напрямую на Т-клетки или опосредованно посредством трансфера MHC/пептидных комплексов и коингибиторных рецепторов. Кроме того, ВВ могут нести на себе такие молекулы, как хемокины, цитокины, FasL, микроРНК и т.д., способные влиять на активацию Т-клеток. Например, иллюстрацией участия в аллореактивности может быть эксперимент, в котором аллогенные экзосомы, экспрессирующие антигены MHC II класса, не смогли запустить in vitro пролиферацию и секрецию IFNγ “наивными” Т-клетками [44]. Таким образом, не похоже, что экзосомы могут служить аналогом антигенпрезентирующих клеток для активации наивных Т-клеток. Причинами тому могут служить недостаточный уровень экспрессии молекул MHC, недостаточная костимуляторная функция экзосом и/или их неспособность запускать продукцию адекватного количества цитокинов (например, IL-1). С другой стороны, возможно, что непрямое взаимодействие экзосом с Т-клетками приводит к Т-клеточной анергии и истощению [43].

Предполагается, что присутствие донор-специфичных экзосом, а также изменения в уровне экзосом в процессе реализации реакций отторжения сможет служить в качестве суррогатного маркера острой или хронической реакции отторжения трансплантированных солидных органов [2][45].

Например, было показано, что у пациентов после ТС спектр переносимых экзосомами белков существенно менялся в зависимости от выраженности реакций отторжения. Более того, для 15 белков были отмечены значительные отличия, а также прямая взаимосвязь с выраженностью иммунного ответа [46]. Таким образом, анализ белкового спектра циркулирующих экзосом может быть эффективным инструментом мониторинга состояния трансплантированного сердца [2].

Другой важнейшей иллюстрацией может быть работа, в которой было показано, что в реакциях острого клеточного отторжения сердца важную роль играют экзосомы, несущие miR-142-3p. Сокультивация указанных экзосом, полученных от пациентов с ТС, с эндотелиальными клетками, приводила к нарушению барьерной функции эндотелия [47].

Вместе с тем экзосомы могут выполнять и протективную функцию в отношении трансплантированного сердца. В частности, как это было показано в работе на моделях прогениторных клеток сердца, в которых количественный и качественный состав экзосом менялся и оказывал защитный эффект на ишемизированный миокард [48].

Заключение

Показано, что кишечная микробиота управляет широким спектром провоспалительных и регуляторных Т-клеточных реакций, которые, вероятно, уравновешивают друг друга для поддержания местного гомеостаза. Увеличение относительного содержания патогенных или “провоспалительных” видов бактерий, способных взаимодействовать с эпителиальными клеткам кишечника, оказывает непосредственное влияние на проницаемость стенки кишки, вызывает развитие воспалительных реакций путем стимуляции “поляризации” Th0 в сторону “провоспалительных” Th17 и развитие различных заболеваний, в основе патогенеза которых лежит неконтролируемое воспаление.

В настоящее время имеются экспериментальные и клинические данные, указывающие на участие Т-клеточного иммунитета в реакциях отторжения трансплантированного сердца, на участие микробиоты кишечника реципиента в процессах регуляции поляризации Т-клеточного ответа, а также на возможное участие ВВ в процессах презентации аллоантигенов Т-клеткам реципиента и, соответственно, развитии иммунного ответа.

Таким образом, для дальнейшего изучения иммунопатогенеза и разработки алгоритмов неинвазивной диагностики реакций отторжения трансплантированного сердца целесообразно провести комплексные исследования взаимодействия оси иммунная система-кишечник-трансплантированное сердце. В частности, определить вклад микровезикул различного клеточного происхождения как реципиента, так и донорского сердца, на активацию реакций отторжения трансплантата сердца; оценить взаимосвязь между составом микробиоты кишечника и активацией поляризации Т-клеточного ответа при развитии системного воспаления после ТС.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 19-75-20076).