Циркулирующие нейтрофилы как показатель системного воспаления при сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса

Участие воспаления в развитии и прогрессировании сердечной недостаточности (СН) с сохраненной фракцией выброса (ФВ) (СНсФВ) на сегодняшний день подтверждено многочисленными данными [1]. Хроническое низкоинтенсивное воспаление вызывает дисфункцию эндотелия коронарного микроциркуляторного русла и способствует привлечению иммунных клеток с последующим развитием фиброза миокарда и прогрессированием диастолической дисфункции [2]. Данные эндомиокардиальной биопсии подтверждают инфильтрацию миокарда воспалительными клетками при СНсФВ [3]. Корреляционные сети, построенные в результате глобального субпопуляционного анализа иммунных клеток с использованием масс-цитометрии, свидетельствуют о перестройке иммунной системы при СНсФВ [4].

Немалым количеством работ продемонстрирована взаимосвязь количества и состава лейкоцитов крови, а также различных лейкоцитарных индексов, с тя­жестью СНсФВ и неблагоприятным прогнозом заболевания. Так, по данным [5], моноцит-­лимфоцитарный и нейтрофил-­лимфоцитарный индексы (НЛИ), наряду с общепринятым показателем концентрации N-концевого промозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP), являлись независимыми предикторами наличия СНсФВ; также показана положительная взаимосвязь этих показателей с функциональным классом СН. В другой работе [6] продемонстрировано, что моноцит-­лимфоцитарный, НЛИ и паниммунный воспалительный индекс (произведение количества нейтрофилов, моноцитов и тромбоцитов, деленное на количество лимфоцитов) оказались независимыми показателями, ассоциированными с наступлением комбинированной конечной точки (общая смертность и госпитализация из-за обострения СН) по данным регрессионного анализа Кокса. Пациенты с СНсФВ, госпитализированные в связи с обострением СН, в течение одного года наблюдения имели более высокие значения НЛИ и толщину эпикардиальной жировой ткани; эти показатели продемонстрировали хорошую предсказательную значимость в отношении СН. Кроме того, пациенты с толщиной эпикардиальной жировой ткани ≥9,45 мм и НЛИ ≥2,83 характеризовались более выраженным ремоделированием миокарда (увеличенные значения индексированных конечно-­систолического объема левого желудочка (ЛЖ) и объема левого предсердия (ЛП), признаки повышенного давления наполнения (ДН) ЛЖ) и имели наибольший риск неблагоприятного исхода [7]. В крупном многоцентровом ретроспективном исследовании Lai W, et al. с медианой наблюдения 4,4 года, включившем 10 тыс. пациентов с СНсФВ, показано, что кумулятивный риск общей и сердечно-­сосудистой смертности был существенно выше у пациентов со значениями системного воспалительного индекса (произведение количества нейтрофилов и моноцитов, деленное на количество лимфоцитов) 4-й квартили [8].

Нейтрофильные гранулоциты представляют собой наиболее многочисленную популяцию циркулирующих лейкоцитов, являются наиболее реактивными иммунными клетками и рассматриваются как активные участники воспалительного процесса. Роль нейтрофильных гранулоцитов при СН, особенно при СНсФВ, изучена еще недостаточно, однако активно обсуждается их возможный вклад в патогенез заболевания. Концентрация миелопероксидазы (МПО), известным источником которой являются активированные нейтрофилы, в крови была значимо выше у пациентов с СНсФВ, по сравнению с контрольной группой, и демонстрировала умеренную диагностическую точность в отношении СНсФВ. Кроме того, показана корреляция уровня МПО в крови с уровнем С-реактивного белка (СРБ), NT-proBNP и соотношением E/e’ [9]. По данным Hage C, et al., концентрация МПО в крови была также значимо выше у пациентов с СНсФВ, по сравнению с группой здоровых лиц, а также у пациентов с СНсФВ с худшими структурно-­функциональными показателями сердца (соотношением E/e’ >14 и индексированным максимальным объемом ЛП >34 мл/м²). Однако в анализе выживаемости в отношении комбинированной конечной точки (смерть по любой причине или госпитализация из-за обострения СН) концентрация МПО не показала статистической значимости [10]. По данным, полученным Almenglo C, et al., экспрессия молекулы адгезии CD11b нейтрофилами была выше у пациентов с СНсФВ и сопутствующим ожирением, по сравнению с пациентами с ожирением или СНсФВ. Это сопровождалось повышенной способностью клеток к миграции in vitro [11].

Цель настоящей работы состояла в оценке количества и фенотипа циркулирующих нейтрофилов у пациентов с различной тяжестью СНсФВ.

Материал и методы

Исследование было выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом института клинической кардиологии им. А. Л. Мясникова (протокол № 306/2024). Все участники исследования подписали письменное информированное согласие. Пациенты обследовались на базе лаборатории фиброза миокарда и СНсФВ Отдела амбулаторных лечебно-­диагностических технологий ФГБУ "НМИЦК им. акад. Е. И. Чазова" Минздрава России.

В исследование было включено 42 пациента с СНсФВ. Критерии включения в исследование: возраст старше 50 лет, симптомы СН, ФВ ЛЖ ≥50%, признаки повышения давления ЛЖ в покое или при нагрузке (соотношение E/e’ >14 и скорость трикуспидальной недостаточности >2,8 м/с). Диагноз СНсФВ выставляли на основании наличия симптомов и признаков СН (II-III функционального класса по классификации NYHA), ФВ ЛЖ ≥50% и повышения ДН ЛЖ в покое (диастолической дисфункции II-III степени), или при физической нагрузке (в ходе диастолического стресс-­теста). Критерием положительного диастолического стресс-­теста являлось допплеровское соотношение E/e’ >14 вместе с максимальной ско­ростью трикуспидальной регургитации >2,8 м/с, достигнутые на любой ступени нагрузки [12]. Из 42 пациентов с СНсФВ 15 пациентов имели начальную стадию (группа "начальная СНсФВ", нормальное ДН ЛЖ в покое и его повышение лишь при нагрузке, т.е. диастолическая дисфункция ЛЖ I степени), 27 пациентов имели выраженную стадию заболевания (группа "продвинутая СНсФВ", повышенное ДН в покое, т.е. диастолическая дисфункция ЛЖ II-III степени). Группу контроля (n=15) составили бессимптомные пациенты с диастолической дисфункцией не более чем I степени. В исследование не включались пациенты c гипертрофической кардиомиопатией, инфильтративными или воспалительными заболеваниями мио­карда; констриктивным перикардитом или значимым перикардиальным выпотом; значимым поражением клапанов сердца; ишемией миокарда во время проведения стресс-­эхокардиографии.

Эхокардиографическое исследование было выпол­нено на ультразвуковом аппарате Vivid E95 (GE Health­ca­re, Норвегия). В ходе исследования определяли структурные и функциональные показатели сердца, допплеровские показатели диастолической функции ЛЖ, показатели лёгочной гемодинамики согласно действующим рекомендациям [13].

Концентрацию NT-proBNP в сыворотке крови определяли на анализаторе Cobas e411 при помощи набора "Elecsys ProBNP II" (Roche, Германия). Концентрацию СРБ в плазме крови определяли высокочувствительным иммуноферментным методом при помощи набора "СРБ-ИФА-БЕСТ высокочувствительный" (Вектор БЕСТ, Россия).

Иммунофенотипирование нейтрофильных гранулоцитов периферической крови проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием флуоресцентно меченных антител к антигенам CD11b и CD66b и наборов для фиксации клеток, в соответствии с инструкциями производителей (BD Biosciences, США). Связывание антител оценивали методом цитофлуориметрии в потоке на приборе FACS Calibur (BD Immunocytometry Systems) (рис. 1). Образцы периферической крови забирались в цитратный антикоагулянт, измерения проводились в течение 1 ч после забора крови.

Статистическая обработка результатов была проведена с использованием статистических программ MedCalc (версия 20.104), R-статистики и библиотеки Python 3.11.11. Данные представлены в виде медианы (интерквартильного размаха), категориальные переменные — в виде доли от группы и процента наблюдений. Различия параметров между группами проверяли с помощью критерия Краскелла-­Уоллиса для множественных сравнений и критерия U-теста Манна-­Уитни для двух категорий. Для сравнения частотных показателей между группами применялся критерий χ² для множественных категорий и критерий Фишера для двух групп. Для анализа взаимо­связи исследуемых параметров использовали метод Спирмена. Для оценки взаимосвязей исследуемых показателей с СНсФВ использовали однофакторный и многофакторный логистический регрессионный анализ. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

В рамках гранта РНФ № 24-75-00053 были выполнены следующие эксперименты: иммунофенотипирование нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, определение концентрации СРБ в крови.

Результаты

Клинико-лабораторная и эхокардиографическая характеристика групп представлена в таблице 1.

Пациенты с СНсФВ были старше и характеризовались худшим функциональным статусом, в отличие от пациентов контрольной группы. Группы пациентов были сопоставимы по остальным основным общеклиническим характеристикам и частоте сопутствующих заболеваний (сахарный диабет (СД) 2 типа, фибрилляция предсердий, ожирение, хроническая болезнь почек), за исключением артериальной гипертензии. Пациенты с СНсФВ чаще принимали бета-адреноблокаторы и петлевые диуретики, по сравнению с группой контроля. Концентрация NT-proBNP была значительно выше у пациентов СНсФВ, по сравнению с группой контроля (p<0,0001), достигая максимальных значений в группе продвинутой СНсФВ (у пациентов с повышенным ДН ЛЖ в покое). Наблюдалась тенденция к более высокой концентрации высокочувствительного СРБ у пациентов с СНсФВ, по сравнению с группой контроля (p=0,07).

Пациенты с СНсФВ имели гипертрофию ЛЖ, при этом индекс массы ЛЖ был выше у пациентов с повышенным ДН ЛЖ в покое. В группе СНсФВ регистрировались закономерно более высокие значения объема полости ЛП, соотношения Е/е’, систолического давления в легочной артерии, по сравнению с пациентами группы контроля. Перечисленные параметры демонстрировали наихудшие значения у пациентов с продвинутой СНсФВ.

У пациентов с СНсФВ абсолютное количество циркулирующих нейтрофилов было выше по сравнению с группой контроля (соответственно 4,0 (3,2; 5,3) vs 3,0 (2,8; 4,3) тыс./мкл, р=0,027), главным образом, за счет активированных нейтрофилов (соответственно 0,74 (0,38; 1,27) vs 0,37 (0,29; 0,72) тыс./мкл, р=0,038, рис. 2). У пациентов с продвинутой СНсФВ количество нейтрофилов было выше по сравнению с пациентами с начальной стадией заболевания, в т.ч. за счет активированных нейтрофилов, однако различия не достигли статистической значимости. Более того, у пациентов с СНсФВ с уровнем NT-proBNP выше медианы (≥318 пг/мл) количество нейтрофилов и активированных клеток было значимо выше (рис. 3). Достоверных различий в содержании других клеток (моноциты, лимфоциты, эозинофилы) не выявлено. Количество нейтрофилов коррелировало с возрастом и уровнем СРБ в общей группе обследованных лиц (r=0,28, р=0,04 и r=0,32, р=0,027, соответственно); корреляции с индексом массы тела не выявлено.

По данным ROC-анализа, абсолютное количество нейтрофилов >3,0 тыс./мкл с чувствительностью 72% и специфичностью 65%, а также абсолютное количество активированных CD11bhighCD66bhigh нейтрофильных гранулоцитов >0,67 тыс./мкл с чувствительностью 83% и специфичностью 52%, ассоциировались с наличием СНсФВ (AUC 0,69 (95% доверительный интервал (ДИ): 0,54-0,84), р=0,025 и AUC 0,69 (95% ДИ: 0,54-0,83), р=0,021, соответственно). Сравнение ROC-кривых (рис. 4) демонстрирует высокую диагностическую точность уровня NT-proBNP. Кроме того, предсказательная значимость содержания циркулирующих в крови нейтрофильных гранулоцитов и активированных клеток превышала таковую для общепринятого маркера системного воспаления СРБ (p=0,35 и р=0,80, соответственно, при сравнении ROC-кривых).

Количество циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов ≥3,3 тыс./мкл (отношение шансов (ОШ) 3,25 при 95% ДИ: 0,94-11,2, р=0,062), также как концентрация СРБ в крови >2,0 мг/л (ОШ 3,1 при 95% ДИ: 0,81-11,84, р=0,11) ассоциировалось с увеличением шансов выявления СНсФВ. При сочетании повышенного количества нейтрофильных гранулоцитов в крови и повышенного уровня СРБ в крови шансы выявления СНсФВ возрастали (ОШ 5,3 при 95% ДИ: 0,85-32,4, р=0,074) (рис. 5).

Согласно результатам однофакторного логистического регрессионного анализа абсолютное содержание циркулирующих нейтрофилов (ОШ 1,65 (95% ДИ: 0,96-2,81, р=0,067)), а также количество активированных клеток повышало шансы выявления СНсФВ (ОШ 5,46 (95% ДИ: 1,11-27,1, р=0,038)). По данным многофакторного логистического регрессионного анализа с поправкой на возраст, индекс массы тела, наличие артериальной гипертензии, соотношение E/e’ и на уровень NT-proBNP, абсолютное количество нейтрофилов сохраняло влияние на выявление СНсФВ (ОШ 0,22 (95% ДИ: 0,05-0,93, р=0,041). Однако по данным многомерного многофакторного логистического регрессионного анализа, абсолютное количество нейтрофилов, включая активированные клетки, оказалось не связанным с тяжестью заболевания.

Обсуждение

Считается, что в основе развития и прогрессирования СНсФВ как возраст-­ассоциированного заболевания лежит хроническое системное воспаление, связанное в т.ч. с реакциями врождённого иммунитета, и приводящее к фибротическим изменениям различных органов, включая миокард. Механизм возрастных изменений связан с перестройкой иммунной системы, прежде всего, за счет иммуносенесценции (возрастной инволюции тимуса и уменьшения продукции наивных лимфоцитов), которая сопровождается компенсаторной активацией неспецифического звена иммунитета и приводит к становлению хронического системного воспаления, т.н. инфламмейджингу [14]. Данное состояние проявляется в том числе увеличением количества циркулирующих нейтрофилов, нейтрофильно-­лимфоцитарного индекса. Активное внимание исследователей направлено на изучение процессов миграции и "перепрограммирования" иммунных клеток в сердце, а также роли про- и противовоспалительных цитокинов в ремоделировании мио­карда [15][16]. Согласно нашим ранее опубликованным данным, ремоделирование миокарда у пациентов СНсФВ связано с расширением популяции циркулирующих промежуточных моноцитов [1], обладающих наиболее выраженными воспалительными свой­ствами [17]. В экспериментальных работах подтверждено участие нейтрофилов в развитии фиброза миокарда [18]. Селективное удаление (цитоферез) активированных нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов рассматривается как перспективный метод лечения СН [19]. В настоящем одномоментном исследовании показано, что абсолютное количество циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов, включая популяцию активированных клеток, было выше у пациентов с СНсФВ, особенно в группе с продвинутой стадией заболевания. Связь циркулирующих нейтрофилов с тяжестью СНсФВ подтверждается и более высоким их количеством в крови у пациентов в зависимости от медианы маркера гемодинамического стресса уровня NT-proBNP в крови. Наши результаты согласуются с рядом опубликованных работ. В ранних исследованиях показано, что дефицитные по MПO мыши устойчивы к индуцированному ангиотензином II фиброзу миокарда предсердий [20]. В культуре нейтрофильных гранулоцитов периферической крови пациентов с СНсФВ и сопутствующим СД 2 типа показана наиболее выраженная способность клеток к продукции интерлейкина-6 и -8 в присутствии липополисахарида, по сравнению с пациентами с СД 2 типа и без СНсФВ и контрольной группой. Данные изменения свидетельствуют об активированном состоянии нейтрофильных гранулоцитов крови у пациентов с СНсФВ, особенно с сопутствующим СД 2 типа, что может служить причиной большей частоты сердечно-­сосудистых событий в данной группе пациентов [21]. Важным подтверждением участия нейтрофильных гранулоцитов в развитии фиброза миокарда и прогрессировании СНсФВ служат результаты работы Martinod K, et al., которые продемонстрировали, что концентрация МПО была значительно выше в крови, полученной из ЛП, у пациентов, перенесших катетеризацию сердца, по сравнению с ее уровнем в периферической крови. Кроме того, выявлена положительная концентрация этого маркера дегрануляции нейтрофилов с индексированным максимальным объемом ЛП и маркерами повреждения миокарда [22]. В нашем исследовании продемонстрирована умеренная статистически значимая предсказательная значимость содержания нейтрофилов, в т.ч. активированных клеток, в отношении СНсФВ; их повышенное количество в крови увеличивало шансы выявления СНсФВ в 3 раза. Проведенный многофакторный логистический анализ не показал независимого влияния циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов в отношении тяжести СНсФВ, что может быть обусловлено многофакторностью и разнообразностью проявлений СНсФВ. Различные подгруппы пациентов (фенотипы) значительно отличаются друг от друга по клинико-­гемодинамическим характеристикам, механизму развития и ответу на проводимую терапию, однако в связи с относительно небольшой выборкой пациентов в данной работе провести дополнительный анализ с использованием фенотипического подхода не представлялось возможным.

Основной детерминантой в патофизиологии СНсФВ является системный провоспалительный статус, который зачастую сопровождает общий процесс старения организма и индуцируется метаболическим стрессом, в частности ожирением. СРБ является общепризнанным маркером резидуального сердечно-­сосудистого риска. Кроме того, повышенные уровни СРБ в крови ассоциируются с неблагоприятным прогнозом СНсФВ [21]. По данным регрессионного анализа Кокса в работе Ferreira JP, et al., концентрация высокочувствительного СРБ >2 мг/л в крови была связана с повышенным риском сердечно-­сосудистой смерти и госпитализации по причине декомпенсации СН [23]. В нашем исследовании концентрация СРБ увеличивалась по мере тяжести СНсФВ (на уровне тенденции), а также коррелировала с количеством циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов, отражая персистирующий системный провоспалительный статус. Отсутствие статистической значимости предсказательной роли СРБ и его независимого влияния в отношении СНсФВ по данным ROC-анализа и логистического регрессионного анализа, соответственно, можно объяснить приемом противовоспалительной терапии у части пациентов (56% принимали статины), а также сравнительно небольшой выборкой пациентов. При этом сочетание повышенного количества нейтрофильных гранулоцитов в крови и повышенного уровня СРБ в крови увеличивало шансы выявления СНсФВ в 5 раз.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии возраст-­ассоциированных изменений иммунитета и системного воспаления при СНсФВ, а также создают основу для применения противовоспалительной терапии. Для подтверждения полученных результатов требуется набор большего количества пациентов с разделением по фенотипу заболевания.

Ограничения исследования. Ограничением настоящего исследования является одномоментный дизайн, не позволяющий доказать причинно-­следственную связь изучаемых показателей с тяжестью СНсФВ. В контрольную группу включались пациенты с незначительными изменениями в миокарде (бессимптомные, с диастолической дисфункцией левого желудочка I степени), в связи с чем подобрать пациентов контрольной группы по типу "случай-­контроль" (полностью сопоставимых по возрасту и частоте артериальной гипертензии) не представлялось возможным.

Заключение

СНсФВ ассоциирована с повышением уровня циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов с признаками активации. Полученные результаты могут служить основанием для изучения вклада врожденного иммунитета в функциональное ремоделирование мио­карда и создают основу для применения противовоспалительной терапии.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 24-75-00053 "Роль иммунных клеток в развитии функциональных и структурных изменений миокарда при СНсФВ" (в рамках гранта выполнены следующие эксперименты: иммунофенотипирование нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, определение концентрации СРБ в крови).