Анализ предикторов артериальной гипертензии с использованием многофакторных моделей через призму процессов старения

Артериальная гипертензия (АГ) — одно из самых распространенных заболеваний, связанных со старением. Пожилые пациенты с АГ часто имеют повышенный риск сердечно-сосудистых осложнений, также АГ связана с ухудшением когнитивных функций [1]. В нашем исследовании мы стремились выявить основные факторы, влияющие на развитие АГ, используя модели логистической регрессии. Были проанализированы генетические и негенетические маркеры, ассоциированные в литературе с различными процессами старения [2], классически не связанными с повышением артериального давления (АД). Таким образом, мы ожидали выявить новые механизмы и процессы, которые независимо ассоциированы с развитием АГ.

Материал и методы

В одномоментное обсервационное исследование были включены 610 человек (из них 225 мужчин). 142 (23,3%) человека имели АГ. Критериями включения явились наличие информированного согласия на участие в исследовании, возраст старше 18 лет, наличие образца буккального эпителия для выделения генетического материала, наличие данных биометрических показателей: АД, рост, вес, индекс массы тела (ИМТ), окружность талии и бедер, заполнение данных анкеты (Приложение 1). Критерии исключения: отсутствие хотя бы одного из критериев включения в исследование. Ответы на вопросы анкеты не были валидированы. В ходе исследования всем участникам было проведено измерение АД на правой руке в сидячем положении после 5 минут отдыха, с использованием осциллометрического автоматического тонометра OMRON. Среднее значение АД рассчитывалось на основе трех измерений. Интервал между измерениями составлял 2 минуты. АГ диагностировалась при систолическом АД (САД) ≥140 мм рт.ст. и/или диастолическом АД (ДАД) ≥90 мм рт.ст., согласно рекомендациям, или при приеме антигипертензивных препаратов последние 2 нед. Также у всех участников измерялась частота сердечных сокращений, рост, вес, ИМТ, окружность талии и бедер.

Всем пациентам проводилось фармакогенетическое тестирование на базе Лаборатории фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Выделение ДНК проводилось из лейкоцитов цельной крови с помощью набора лабораторных реагентов для выделения "ДНК-ЭКСТРАН-1" (ЗАО "Синтол", Россия). Выделенная ДНК хранилась при температуре -80 °C. Определение аллелей проводилось методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-Time PCR) на приборе Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Inc., США).

Был проведен анализ, включающий различные методы проверки и фильтрации данных, чтобы обеспечить достоверность результатов. Выявление предикторов АГ проводили построением моделей логистических регрессий. С помощью однофакторных моделей определяли отдельные предикторы, ассоциированные с риском развития АГ. Из совокупности ковариат с достигнутым в однофакторных моделях уровнем значимости p<0,3 методами прямого и обратного шага строили оптимальные по информационному критерию Акаике модели многофакторной логистической регрессии. Все модели прямого и обратного шага совпали. Для многофакторной модели логистической регрессии методами ROC-анализа выявляли наилучший с точки зрения отношения чувствительности и специфичности порог классификации, строили таблицу соответствия (сопряженности), по которой рассчитывали прогностические показатели: чувствительность, специфичность, частоту случаев метода, фактическую частоту случаев. Тестом Hosmer-Lemeshow исследовали согласованность прогностических частот откалиброванной модели с фактическими частотами негативных событий.

Проверку статистических гипотез проводили при критическом уровне значимости р=0,05, т.е. различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Все статистические расчеты выполняли в программе R-Studio (версия 2022.07.2+576 Spotted Wakerobin, США) на языке R (версия 4.1.3, Австрия).

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ИХБФМ СО РАН от 23.08.2022. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие.

Результаты

Представленность АГ у участников исследования с учетом пола и возраста соответствовала таковой в исследовании ЭССЕ-РФ [3]. Описательная статистика исследуемых предикторов, продемонстрировавших статистическую значимость, представлена в Приложении 2.

Для определения предикторов АГ использован метод логистической регрессии для однофакторной и многофакторной моделей (Приложение 3). Путем построения однофакторных моделей логистической регрессии выявлены отдельные значимые предикторы гипертонической болезни (ГБ) у всех пациентов. Из совокупности ковариат с достигнутым уровнем значимости p<0,3 в однофакторных моделях была построена модель многофакторной логистической регрессии. Для многофакторной прямой и обратной модели с помощью ROC-анализа были определены наилучшие показатели чувствительности — 71,8% и специфичности — 86,3% для порогового значения вероятности ГБ =23,8% [4]. Таким образом, y пациентов, у которых рассчитанная по формуле модели вероятность АГ превышала 23,8%, прогнозировали развитие АГ.

При однофакторном анализе в нашем исследовании была показана статистически значимая ассоциация АГ и таких негенетических факторов, как САД >122,5 мм рт.ст., ДАД >83,8 мм рт.ст., ИМТ >27,7 кг/м², индекс талии/бедер >0,88, отягощенный наследственный анамнез по сердечно-сосудистым заболеваниям, присутствие в анамнезе атеросклероза любой локализации, общий холестерин ≥5,2 ммоль/л, мужской пол, отягощенный наследственный анамнез по метаболическому синдрому (p<0,001 для каждого из показателей), а также некоторых других, в т.ч. генетических маркеров: GC rs2282679 (р=0,014), VDR rs2228570 (р=0,034), CFH rs1061170 (р=0,035) (см. Приложение 2).

Однако при многофакторном анализе наилучшие чувствительность и специфичность показала совокупность только генетических факторов.

Формула многофакторной модели АГ у всех пациентов представлена в общем виде в Приложении 4 и в виде таблицы (табл. 1).

Для исследования прогностических свойств многофакторной модели АГ составлена таблица соответствия (табл. 2) и рассчитаны прогностические показатели. Суммарное количество пациентов в многофакторной модели — 610, случаев 142 (23,3%). Полученный уровень значимости теста Hosmer-Lemeshow (p=0,1345027) свидетельствует о согласованности прогностических частот откалиброванной модели с фактическими частотами возникновения АГ. Комплексная метрика (AUC=85,7) демонстрирует очень хорошее качество классификации модели (рис. 1).

Обсуждение

При однофакторном анализе мы получили стандартные факторы риска АГ, такие как ИМТ >27,7 кг/м², индекс талии/бедер >0,88, отягощенный наследственный анамнез по сердечно-сосудистым заболеваниям, присутствие в анамнезе атеросклероза любой локализации, общий холестерин ≥5,2 ммоль/л, мужской пол, отягощенный наследственный анамнез по метаболическому синдрому, что соответствует современным представлениям о факторах риска ГБ [2]. Стоит отметить, что с наличием диагноза "гипертоническая болезнь" коррелировали довольно низкие, практически целевые уровни САД и ДАД (>122,5 мм рт.ст. и >83,8 мм рт.ст., соответственно), что, возможно, объясняется приемом пациентами регулярной гипотензивной терапии.

Также статистически значимую ассоциацию с АГ в однофакторном анализе показали такие генетические факторы, как генотип АА гена GC rs2282679, генотип СС гена VDR rs2228570 и генотип СС гена CFH rs1061170.

В результате исследования была получена математическая модель логистической регрессии, все значимые предикторы — полиморфизмы генов. В отличие от большинства исследований, где генетические маркеры, включенные в модель, ассоциированы только с АГ [5], мы проанализировали пул маркеров, которые использовались для оценки связи с распространенными возраст-зависимыми заболеваниями и сосудистым старением [1]. В данной работе мы преследовали цель потенциально обозначить те механизмы, которые сочетаются как независимые факторы и могут влиять на развитие АГ. Поэтому преимущество генетических факторов в модели можно расценивать как более точную замену других негенетических факторов, которые обычно присутствуют в моделях, например, такие как возраст, ИМТ, индекс талии/бедер и др. Так как мы использовали не коррелирующие предикторы, ожидалось, что ковариаты, вошедшие в модель, могут отображать укрупненные биологические процессы. Кроме привычных генов, ассоциированных в литературе с АГ (например, EDN1, AGTR1), в генетическую модель вошли и другие генетические маркеры, ассоциированные ранее с другими возраст-ассоциированными заболеваниями.

Следующие гены показали свой независимый вклад в модель, прогнозирующую вероятность возникновения АГ.

Ген EDN1 кодирует белок эндотелин-1. Эндотелин-1 в низких концентрациях взаимодействует с рецептором ETВ на поверхности эндотелия, что запускает каскад реакций, приводящих к вазодилатации. В более высоких концентрациях эндотелин-1 взаимодействует также с рецепторами ETA, что в итоге приводит к вазоконстрикции за счет высвобождения кальция в гладких мышцах сосудистой стенки. Также эндотелин-1 обладает митогенным действием на клетки гладких мышц сосудов и миоциты, что может приводить к утолщению стенки сосудов и ремоделированию сердца. Наличие гомозиготы Т/Т в локусе rs5370 гена EDN1 было ассоциировано с повышением риска АГ, что согласуется с данными литературы [6].

Ген CAT кодирует фермент каталазу, расщепляющую пероксид водорода на воду и кислород [7]. Наличие гомозиготы G/G в локусе rs1001179, располагающемся в промоторной области гена, статистически значимо повышало вероятность риска развития АГ в нашем исследовании

Ген FOXO1A кодирует белок семейства FoxO транскрипционный фактор, который запускает сигнальную последовательность, приводящую к выделению инсулин/инсулиноподобного гормона роста, играет роль в регуляции оксидативного стресса, апоптоза, аутофагии, клеточного цикла и в митогенезе. Согласно данным литературы, в периоды зрелости и старости происходит снижение числа носителей генотипа FOXO1A G/G в локусе rs4943794 (отношение шансов =0,984, P=0,004), а среди женщин, достигших возраста 90 лет, реже встречался генотип С/С, чем в общей популяции (отношение шансов =0,772, P=0,028) [8]. В нашем исследовании наличие гомозиготы С/С FOXO1A rs4943794 было ассоциировано с повышением риска развития АГ.

Ген CFB кодирует фактор комплемента B. Он относится к ранним факторам системы комплемента и обладает протеолитической активностью. Избыточная активация фактора комплемента В за счет наличия аллеля А в rs4151667 приводит к усилению иммунного воспаления за счет увеличения количества белка. В результате между сетчаткой и мембраной Бруха скапливаются друзы — желтоватые кристаллы, в состав которых входят белки системы комплемента [9]. Носительство гомозиготного генотипа ТТ CFB rs4151667 было ассоциировано в нашем исследовании с увеличением риска АГ.

Ген CYBA кодирует бета-субъединицу NADPH-оксидазу (NOX) — клеточного мембрано-связанного мультимолекулярного ферментного комплекса, локализующегося на плазматической мембране и в некоторых органеллах. Особенно обогащены этим ферментом фагоцитарные клетки, такие как макрофаги. Эти оксидазы участвуют в клеточной противомикробной защитной системе, а также в клеточной пролиферации, дифференцировке и регуляции экспрессии генов. В литературе наличие генотипа ТТ в локусе CYBA rs4673 было ассоциировано с повышением продукции свободных радикалов нейтрофилами, повышением риска ишемической болезни сердца, сахарного диабета 2 типа в сочетании с другими факторами риска [10]. В нашем исследовании также выявлена ассоциация генотипа ТТ CYBA rs4673 с повышением риска АГ.

Ген TERC кофактор в работе теломеразы — последовательность РНК в составе рибонуклеопротеида-теломеразы, обеспечивающей поддержание длины теломер хромосом. Было показано, что более короткая средняя теломер хромосом лейкоцитов связана с риском развития ряда возрастных заболеваний и предлагается как маркер биологического старения. В литературе наличие генотипа GG TERC rs12696304 было ассоциировано с склонностью к укорочению теломер и более раннему старению [11]. В нашем исследовании наличие гетерозиготы СG TERC rs12696304 было ассоциировано с повышением риска АГ.

Ген TSLP кодирует тимический стромальный лимфопоэтин — белок, принадлежащий к семейству цитокинов, который играет важную роль в созревании популяций Т-клеток за счет активации антигенпредставляющих клеток и привлекает лимфоциты в легочную ткань. Возможно, участвует в ремоделировании бронхов. Наличие хотя бы одного аллеля Т TSLP rs1837253 было ассоциировано со снижением риска развития бронхиальной астмы во взрослом возрасте по данным литературы [12]. Наличие гомозиготы ТТ TSLP rs1837253 в нашем исследовании повышало риск развития АГ.

Ген CFH кодирует фактор комплемента Н (Complement Factor H), известный как бета-1Н-белок — сывороточный гликопротеин из суперсемейства регуляторных белков системы комплемента. Этот участок входит в состав сайта связывания CFH с С-реактивным белком — белком острой фазы воспаления. Генотип С/С rs1061170 ассоциирован с повышенным уровнем С-реактивного белка в сосудистой оболочке глаза, что может провоцировать хроническое воспаление и развитие макулярной дегенерации. Исследования показали, что неизмененный вариант фактора Н (кодируется аллелем Т) позволяет лучше и эффективнее удалять продукты распада клеток, уменьшать воспаление и защищать от развития патологии [9]. В этом исследовании наличие генотипа С/С rs1061170 ассоциировано с повышенным риском развития АГ.

Ген DPP4 кодирует фермент дипептидилпептидазу-4 — мембранный фермент, экспрессирующийся на поверхности большинства клеток организма, в т.ч. на нейронах. Участвует в иммунной регуляции и в апоптозе. Является внутримембранным гликопротеином и сериновой экзопептидазой, которая расщепляет пептидную связь в дипептиде X-пролин от N-конца полипептидов и белков. По данным литературы, у носителей хотя бы одного аллеля С DPP4 rs6741949 повышен риск быстрого снижения массы гиппокампа после 70 лет, что является признаком старения нервной системы и может привести к развитию болезни Альцгеймера [13]. В нашем исследовании генотип СG DPP4 rs6741949 обладал небольшим протективным действием и был ассоциирован со снижением риска развития АГ.

VDR — ген рецептора к витамину D. Через взаимодействие с рецептором витамин D индуцирует синтез остеокальцина — основного неколлагенового белка костной ткани. Однонуклеотидные замены в rs2228570 VDR снижают афинность рецептора к витамину D. Наличие хотя бы одного аллеля Т в rs2228570 VDR ассоциировано со снижением плотности кости, эффект выражен сильнее у носителей гомозиготного варианта Т/Т [14]. В этом исследовании наличие генотипа GG было ассоциировано с некоторым снижением риска АГ.

Ген BCMO1 кодирует бетакаротенмонооксигеназу-1, которая осуществляет превращение пищевых β-каротинов в ретиналь (провитамин А). Полиморфизмы в этом гене ассоциированы со сниженной скоростью метаболизма ретиноидов и как следствие со сниженным уровнем витамина А. Является фактором риска повышения окислительного потенциала клетки (возникновения оксидативного стресса). По данным исследований, наличие хотя бы одного аллеля Т rs7501331 гена BCMO1 приводит к уменьшению преобразования β-каротина в ретинол [15]. В нашем исследовании гетерозиготный генотип СТ был ассоциирован со снижением риска АГ, в отличие от гомозиготных вариантов СС и ТТ. Возможно, что вклад генотипа ТТ не показал своей протективной значимости в отношении ГБ из-за небольшого количества таких образцов в нашей выборке.

Ген GC кодирует белок, который принадлежит к семейству генов альбумина. Это многофункциональный белок, обнаруженный в плазме, асцитической жидкости, цереброспинальной жидкости и на поверхности многих типов клеток. Он связывается с витамином D и его метаболитами в плазме и переносит их в целевые ткани. Мутация в гене ассоциирована со снижением концентрации витамина D [16]. В этой работе выявлен вклад генотипа А/А rs2282679 в снижение риска АГ.

Ген SLC23A1 кодирует белок-транспортер витамина С в эпителиальных клетках кишечника. Полиморфизм ассоциирован со сниженным уровнем витамина С в сыворотке крови, поскольку наличие хотя бы одного минорного аллеля Т в гене SLC23A1 rs33972313 приводит к снижению специфичности белка, что приводит к снижению эффективности транспорта витамина С в клетку [17]. В нашем исследовании генотип GG был ассоциирован со снижением риска АГ.

Ген AGTR1 кодирует белок — рецептор к ангиотензину II 1 типа. В нашей работе выявлен протективный вклад генотипа С/С rs5186 гена AGTR1 в развитие АГ. В большинстве научных работ носительство аллеля С rs5186 гена AGTR1 было ассоциировано с повышением риска АГ, хотя есть и единичные работы о протективном эффекте в Тайской популяции [18].

Ген CEPT — кодирует транспортер эфиров холестерина. Его функция заключается в метаболизме холестерина из липопротеидов высокой плотности в липопротеиды низкой плотности. Носители генотипа GG rs5882 гена CEPT имеют склонность к более высокому уровню липопротеидов высокой плотности, удлинению продолжительности жизни и снижению риска деменции и болезни Альцгеймера [19]. В нашем исследовании генотип GG rs5882 гена CEPT был ассоциирован со снижением риска АГ и вносил основной вклад в модель.

Заключение

В результате работы нами была создана математическая модель, способная прогнозировать повышенный риск АГ. Несмотря на то, что изначально в анализ были включены как классические негенетические, так и генетические факторы, наибольшей чувствительностью и специфичностью обладала модель, содержащая только генетические маркеры. Среди этих маркеров были как уже известные аллели, ассоциированные с повышением риска АГ, так и новые маркеры, которые не изучались ранее в связи с повышением АД и были ассоциированы в литературе с другими процессами, связанными со старением в широком смысле. Также важно отметить, что модель выявила не только рисковые факторы, но и протективные аллели, а также позволила ранжировать их вклад в развитие заболевания.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.