Анализ полиморфизмов в генах VDR, ADRB1, SP4, ММР3 и ММР9 у больных с синдромом Вольфа-Паркинсона-Уайта

Синдром Вольфа-Паркинсона-Уайта (ВПУ) представляет собой анатомический субстрат развития дополнительного предсердно-желудочкового пути — пучка Кента, что приводит к раннему возбуждению желудочков сердца, сопровождающемуся возникновением атриовентрикулярных пароксизмальных тахикардий, имеющих ярко выраженную клиническую симптоматику и являющихся поводом для обращения к врачу-терапевту и в дальнейшем к врачу-кардиологу. При этом на рутинной электрокардиограмме (ЭКГ) могут быть описаны такие изменения, как укорочение интервала PQ; визуализация на восходящем колене зубца R дополнительной волны возбуждения — дельта-волны; увеличение продолжительности комплекса QRS; дискордантное смещение RS-T и изменение полярности зубца T (непостоянный признак).

Основным патогномоничным признаком, позволяющим дифференцировать феномен ВПУ, являются зарегистрированные на ЭКГ, симптомные пароксизмальные наджелудочковые тахиаритмии — атриовентрикулярные узловые тахикардии с антеградным и ретроградным путем проведения импульса, либо пароксизмы фибрилляции и трепетания предсердий, которые требуют применения антиаритмической медикаментозной терапии или применения радиочастотной аблации дополнительного проводящего пути — пучка Кента.

Анализ данных литературы показал, что наличие признаков преэкзитации, выявляемых на ЭКГ, присутствует у 0,15-0,25% населения в целом [1]. Синдром ВПУ чаще диагностируется у мужчин, чем у женщин, но у детей разницы между полами не наблюдается. Среди людей с синдромом ВПУ у 3,4% есть родственники первой степени родства с признаками предвозбуждения на ЭКГ, причем семейная форма обычно наследуется как аутосомно-доминантный признак [2]. Это служит дополнительным фактором о понимании наследственной отягощенности и проявляемости наличия пучка Кента в поколениях. Клиническая манифестация синдрома ВПУ не зависит от возраста и может протекать бессимптомно, либо представлять собой внезапный приступ учащения сердцебиения [3]. В случае "запуска" атриовентрикулярной реципрокной тахикардии (АВРТ), антероградное проведение импульса пойдет через атриовентрикулярный узел, а ретроградно импульс пойдёт через дополнительное атриовентрикулярное соединение и в этих случаях дифференциальная диагностика идет в т.ч. по анализу желудочкового комплекса QRS.

Морфологическая основа синдрома ВПУ — это так называемый новый проводящий путь (пучок Кента), который шунтирует атриовентрикулярное соединение и обеспечивает движение электрического импульса. Нарушение ритма при синдроме ВПУ связано как с антероградным, так и ретроградным проведением импульса. Термин феномена ВПУ был введен в научное сообщество в 1980г. Он означает наличие предвозбуждения желудочков без появления АВРТ.

В сердечной мышце, в частности в проводящей системе сердца, различают дополнительные соединения или "пучки Кента" (они начинаются и заканчиваются в рабочем миокарде), и дополнительные тракты, внедряющиеся в специализированную проводящую систему сердца. В литературе также выделяют понятие "злокачественный пучок Кента", в данном случае при определении точки Венкебаха пучка Кента проведение >250 импульсов/мин, а эффективный рефрактерный период пучка Кента — <250 мс.

В проведенных ранее исследованиях не было установлено связи синдрома ВПУ с патологическими изменениями анатомии сердца. Однако была показана ассоциативная связь развития синдрома ВПУ с молекулярно-генетическими полиморфными вариантами различных генов [4-6].

В соответствии с клиническими рекомендациями по недифференцированным дисплазиям соединительной ткани, в настоящей работе были выбраны для анализа некоторые однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) в генах, ассоциированных с анатомическими субстратными изменениями сердца. В частности, ген ADRB1, кодирующий адренорецептор бета-1. Бета-1 адренорецепторы преимущественно расположены в сердце. ОНП rs1801252 представляет собой замену аденина на гуанин в 145 положении (A145G), что приводит к изменению аминокислотного состава белка (Ser49Gly). Было показано, что этот ОНП может влиять на частоту сердечных сокращений в состоянии покоя, а также может быть вовлечен в формирование ремоделирования левого желудочка и развитие сердечной недостаточности (СН) [7]. Ген SP4 является транскрипционным фактором, который влияет на модуляцию экспрессии гена, кодирующего коннексин-40, в свою очередь, влияющий на ультраструктурные особенности проводящей системы сердца и ее функциональное состояние. Носительство гомозиготного генотипа Т80807T полиморфизма rs1011168 ассоциировано с развитием неблагоприятных сердечно-сосудистых проявлений [8]. Ген ММР3 кодирует металлопротеиназу-3, по литературным данным связанную с эффективностью регенерации и ремоделирования миокарда. Аллельный вариант 5А полиморфизма rs35068180 связан с более высокой активностью промотора, чем 6А, что сказывается на количестве матричной РНК (мРНК) и белка ММР3 в клетках [9]. Полиморфизм -8202A/G (rs11697325) гена MMP9 относится к некодирующему региону (5′-нетранскрибируемый регион), который, однако, может либо положительно влиять на транскрипцию и уровень белка ММР9, либо характеризоваться потерей репрессора и также повышать продукцию ММР9. Ранее была показана связь генотипа AA с различными заболеваниями сердечно-сосудистой системы [10]. Повышенный риск сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) может быть связан с дефицитом витамина D [11]. Уровень витамина D регулируется геном VDR, кодирующим белковый рецептор витамина D. Данный рецептор локализован в ядре клеток органов-мишеней и связывается с кальцитриолом, что, в свою очередь, влияет на экспрессию других генов. В настоящее время в гене VDR обнаружены различные вариации, которые могут изменять его активность. Одна из наиболее значимых — BsmI (нуклеотидная замена G>A, rs1544410) [12].

Таким образом, цель исследования — провести анализ ассоциации полиморфизмов в генах VDR (rs1544410), ADRB1 (rs1801252), SP4 (rs1011168), ММР3 (rs35068180) и ММР9 (rs11697325) с синдромом ВПУ.

Материал и методы

В исследование включались пациенты с синдромом ВПУ, поступившие в кардиохирургическое отделение ФГБУ ФЦССХ г. Красноярска, имевшие все критерии включения и не имевшие ни одного критерия исключения. Критерии включения: 1) возраст старше 18 лет; 2) пациент способен прочитать информационный листок и добровольно подписать информированное согласие; 3) подтвержденный диагноз синдрома ВПУ. Критерии исключения: 1) возраст менее 18 лет; 2) отказ пациента от участия в исследовании; 3) отсутствие технической возможности для проведения венепункции (поражение поверхностных вен, воспаление кожных покровов); 4) наличие острых или обострение хронических заболеваний на момент проведения исследования, подтверждённых с помощью стандартных лабораторных методов исследования.

Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого (Протокол № 109 от 16.11.2021). Все участники подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании и отбор биоматериала для анализа.

Всего в исследование было включено 169 пациентов с синдромом ВПУ. Средний возраст участников составил 39,83±17,80 лет, при этом возрастной диапазон колебался от 13 до 74 лет. В общей группе было 77 мужчин (45,6%) и 92 женщины (54,4%).

Всем пациентам было проведено клинико-инструментальное исследование, включающее в себя проведение ЭКГ, холтеровского мониторирования ЭКГ, эхокардиографического обследования, общеклинические анализы крови и анализ на гормоны щитовидной железы, а также был произведен забор крови для молекулярно-генетических исследований.

В таблице 1 представлено распределение больных с синдромом ВПУ по клиническим вариантам синдрома. Так, манифестирующий вариант встречался у 47% больных, интермиттирующий — у 26%, скрытый — 26%, феномен ВПУ — у 1% пациентов.

При анализе результатов холтеровского мониторирования ЭКГ у 118 из 169 пациентов наблюдались следующие нарушения сердечного ритма и проводимости. Миграция водителя ритма по предсердиям — 8,5%, синусовая аритмия — 23,7%, пароксизмы неустойчивой наджелудочковой тахикардии — 28,0%, атриовентрикулярная тахикардия — 1,7%, пароксизмы неустойчивой желудочковой тахикардии 4,3%, а также фибрилляция предсердий — 5,9%. Такие нарушения проводимости, как полная блокада правой и левой ножек пучка Гиса наблюдались, соответственно, в 17,8 и 4,2% случаев. Неполная блокада правой ножки пучка Гиса как вариант структурной нормы проводящей системы сердца наблюдалась у 5,9% пациентов (табл. 2). Верификация множественных нарушений сердечного ритма и проводимости у больных с синдромом ВПУ дополнительно указывает на гетерогенность проводящих путей сердца.

Сбор анамнеза и клинико-инструментальное обследование больных с синдромом ВПУ выявило различную сердечно-сосудистую патологию у 107 из 169 обследуемых, а также у 2 пациентов выставлен диагноз бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) и у 5 пациентов — сахарный диабет (СД) 2 типа. При анализе сердечно-сосудистой патологии у больных с синдромом ВПУ наиболее частой патологией являлась гипертоническая болезнь I-III стадии — 39,5%; ишемическая болезнь сердца: стенокардия II-III функционального класса встречалась у 14,0% больных, признаки ремоделирования сердца и развитие СН I-II функционального класса наблюдались у 23,7% больных. Из внекардиальной патологии — бронхиальная астма/ХОБЛ выявлялась у 1,7% больных, СД 2 типа — у 4,4% пациентов с синдромом ВПУ (табл. 3).

Для проведения сравнительного анализа по частоте встречаемости изучаемых полиморфизмов в генах VDR (rs1544410), ADRB1 (rs1801252), SP4 (rs1011168), ММР3 (rs35068180) и ММР9 (rs11697325) в группе пациентов с синдромом ВПУ с соответствующими результатами группы контроля была подобрана когорта лиц из популяции людей без заболеваний сердечно-сосудистой системы, которые проживали на территории Октябрьского района г. Новосибирска. Данная контрольная группа состояла из 158 человек, из них 98 мужчин и 60 женщин. Возрастная группа в среднем — 44,96±16,06. Результаты исследования этих пациентов были получены по итогу исследований Всемирной организации здравоохранения "MONICA" и "HAPPIE". Молекулярно-генетическое исследование образцов ДНК этих пациентов проводилось нами в ходе настоящего исследования.

ДНК выделялась из лейкоцитов цельной крови фенол-хлороформным методом. Генотипирование генов VDR (rs1544410) и MМР9 (rs11697325) проводили с использованием соответствующих коммерческих наборов реагентов для выявления полиморфизмов в геноме человека (ООО НПФ "Литех", Москва).

Генотипирование генов SP4 (rs1011168), ADRB1 (rs1801252) и ММР3 (rs35068180) проводилось с использованием комплекта реагентов для амплификации "ПЦР-Комплект" ("Синтол", Москва). Анализ гена SP4 (rs1011168) проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретическим способом детекции продуктов амплификации. Использованные аллель-специфичные праймеры были заимствованные из статьи Шабалин А. В. и др. (2003): F1(А):5′-AAATGAGGACAATGAAAAGCACA-3′; R1(А):5′-GCCTAAGCTGCTACTATTTCAGTG-3′; F2(T):5′-ACTGTTGCCCTTTGTTGCCA-3′; R2(T):5′-CATTTCTCAATTGCCTGCTATAGA-3′ [8]. Для анализа ADRB1 (rs1801252) использовали следующие праймеры: F:5′-CTGCTGGTGCCCGCGTCGC-3′ и R:5′-ATCACCAGCACATTGCCCGCCA-3′. Далее проводили анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Рестрикцию ПЦР-продукта проводили 10 ед. рестриктазы HaeIII и инкубацией при 37 °C в течение 16 ч. Для анализа ММР3 (rs35068180) использовали праймеры, заимствованные из Dunleavey, et al. (2000): F:5′-GATTACAGACATGGGTCACA-3′; R:5′-TTTCAATCAGGACAAGACGAAGTTT-3′. Далее также проводили анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Рестрикцию ПЦР-продукта проводили 10 ед. рестриктазы Mrox I и инкубацией при 37 °C в течение 16 ч [13].

Расчеты проводились в пакете прикладных программ MS Excel 2010. Частоту встречаемости полиморфизмов в исследуемых генах рассчитывали как процент встречаемости гетерозигот и мутантных гомозигот от общего количества полученных результатов у людей в соответствующих группах.

Анализ данных проводился с помощью программного пакета Statistica версии 7.0. Оценка межгрупповых различий и соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга выполнялась с использованием критерия χ². За статистически значимый уровень достоверности принимали р<0,05, статистическую тенденцию к достоверности — 0,05<р<0,1. Для оценки ассоциации генотипических характеристик с риском заболевания использовалось отношение шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). ОШ =1 указывало на отсутствие ассоциации; значение ОШ >1 указывало на положительную ассоциацию, а ОШ <1 — на отрицательную ассоциацию.

Результаты

Частота встречаемости генотипов изучаемых полиморфизмов rs1544410, rs1801252, rs1011168, rs35068180 и rs11697325 среди пациентов с ВПУ и людей из контрольной группы представлена в таблице 4.

Дополнительно оценивалась частота встречаемости различных генотипов в группах с различными клиническими вариантами синдрома, исключая лишь группу с феноменом ВПУ вследствие недостаточной выборки (n=2) (табл. 5).

Частота гомозиготного генотипа GG гена VDR (rs1544410) составила 45,0% в группе пациентов с синдромом ВПУ vs 47,0% в контрольной группе. При этом стоит отметить, что у пациентов с манифестирующим вариантом синдрома данный генотип встречается чаще, чем в двух других группах (54,4% vs 34,9% и 37,8%). Соответственно, частота гетерозиготного генотипа GA для всех трех групп также различается: чаще всего встречается в группе со скрытым вариантом синдрома (55,6%), реже — с манифестирующим (36,7%). Гомозиготный генотип АА, наоборот, чаще встречается в группе с интермиттирующим вариантом синдрома (16,3%). При этом уровень значимости р>0,05 во всех исследуемых группах.

Частота гомозиготного генотипа АА гена ADRB1 (rs1801252) составила 74,0% в группе пациентов с синдромом ВПУ vs 70,0% в контрольной группе; генотипа AG — 23,7% vs 26,4%; генотипа GG — 2,4% vs 3,2%; уровень значимости р=0,63. Статистически значимых различий по группам также отмечено не было. По литературным данным, встречаемость редкого гомозиготного варианта составляет ~3% [14].

Частота гомозиготного генотипа АА гена SP4 (rs1011168) составила 46,7% в группе пациентов с синдромом ВПУ vs 40,3% в контрольной группе; генотипа AТ — 37,9% vs 45,5%; генотипа ТТ — 14,8% vs 14,3%; уровень значимости р=0,23. При проведении сравнительного анализа групп с различными вариантами синдрома было показано, что генотип АА преобладает в группе с интермиттирующим вариантом (60,4%; ОШ =2,27, р=0,04), что говорит о том, что носительство данного генотипа в 2,27 раз повышает риск возникновения данной формы синдрома ВПУ.

Частота гомозиготного генотипа 5А/5А гена ММР3 (rs35068180) составила 19,5% в группе пациентов с синдромом ВПУ vs 31,4% в контрольной группе; генотипа 5А/6А — 50,3% vs 57,8%; генотипа 6А/6А — 30,2% vs 10,8%; уровень значимости р=0,05. Так, носительство генотипа 5А/5А снижает риск возникновения синдрома ВПУ в 2 раза (31,4% в группе контроля vs 19,5% в группе с синдромом ВПУ, ОШ =2,01). В этом случае принимается р=0,05, что свидетельствует о статистической тенденции к достоверности. Результаты анализа по группам гена ММР3, однако, показывают, что вариант 5А/5А повышает риск развития синдрома ВПУ у пациентов с интермиттирующим (ОШ =2,19, р=0,17) и скрытым (ОШ =3,02, р=0,02) вариантом синдрома. При этом стоит отметить, что такой генотип также чаще встречается в группе контроля (31,4% vs 21% и 26,7%, соответственно).

Частота гомозиготного генотипа АА гена ММР9 (rs11697325) составила 32,5% в группе пациентов с синдромом ВПУ vs 24,1% в контрольной группе; генотипа AG — 43,8% vs 54,2%; генотипа GG — 23,7% vs 21,8%; уровень значимости р=0,23. При проведении сравнительного анализа выявлено, что частота встречаемости аллеля дикого типа А гена ММР9 встречается чаще у пациентов с синдромом ВПУ, чем у пациентов контрольной группы (32,5% vs 24,1%, ОШ =1,73, p=0,04). Соответственно, носительство генотипа АА гена ММР9 rs11697325 повышает риск развития синдрома ВПУ в 1,73 раза. Статистически значимых различий по группам показано не было.

Таким образом, при сравнении частоты встречаемости изучаемых полиморфизмов между пациентами с синдромом ВПУ и группой контроля достоверные отличия выявлены по rs35068180 в гене ММР3 и rs11697325 в гене ММР9. По полиморфизмам VDR (rs1544410), ADRB1 (rs1801252) и SP4 (rs1011168) отличий не выявлено. При сравнении частоты встречаемости генотипов по пяти изучаемым полиморфизмам между группами пациентов с различными клиническими вариантами синдрома ВПУ достоверные отличия обнаружены по rs1011168 в гене SP4 и rs35068180 в гене ММР3.

Обсуждение

Согласно клиническим рекомендациям по недифференцированным дисплазиям соединительной ткани, для нашего исследования были выбраны те ОНП, с которыми, по литературным данным, ранее была установлена ассоциация развития дисплазии соединительной ткани при нарушениях сердечного ритма и проводимости: гомозиготный генотип Т80807T полиморфного гена SP4; гомозиготный генотип АА полиморфного гена ADRB1; гетерозиготный генотип 5А/6А полиморфного гена ММР3; гомозиготный генотип GG гена ММР9 (-8202 A/G).

В исследовании, проведенном ранее, было показано, что полиморфизм гена SP4 (rs1011168) может быть ассоциирован с электрофизиологическими особенностями проводящей системы сердца у больных с синдромом ВПУ за счет влияния на экспрессию гена, кодирующего коннексин-40 [8]. Однако, по результатам проведенного нами исследования, при увеличении выборки пациентов с синдромом ВПУ, статистически значимых различий получено не было.

Ассоциация полиморфизма гена ADRB1 ранее была показана у пациентов с впервые выявленными нарушениями сердечного ритма, такими как АВРТ, включая пациентов с синдромом ВПУ. Было показано, что полиморфизм A145G (Ser49Gly) гена ADRB1 может быть вовлечен в процессы ремоделирования сердца, однако для подтверждения гипотезы об использовании полиморфизма как предиктора ССЗ авторы отмечали необходимость проведения дополнительных исследований [7]. Исходя из полученных нами результатов, полиморфизм гена ADRB1 не является значимым для вклада в молекулярно-генетическую диагностику синдрома ВПУ.

Согласно данным литературы, белки семейства металлопротеиназ могут быть связаны с эффективностью регенерации и ремоделирования миокарда левого желудочка. При этом известно, что белок ММР-3, кодируемый геном ММР3, играет важную роль в процессах регенерации. Аллельный вариант 5А (ААААА) этого гена связан с более высокой активностью промотора, чем вариант 6А. Это сказывается на уровне мРНК и белка ММР-3 в клетках. При этом показано, что белок ММР-3 отвечает за активацию иных белков семейства: ММР-1, ММР-2 и ММР-9, что играет важную роль в регуляции процессов перестройки внеклеточного матрикса и обеспечении функционирования органов и тканей [9]. В нашем исследовании было показано, что носительство гомозиготного генотипа 5А/5А снижает вероятность формирования патологического пучка Кента и формирования признаков синдрома ВПУ. При этом в исследовании, проведенном ранее российскими коллегами, было показано, что преобладание гетерозиготного генотипа 6А/5А может быть предиктором развития хронической СН [15].

Ранее было показано, что генотип АА гена ММР9 повышает риск развития неблагоприятных сердечно-сосудистых проявлений более чем в 2 раза [10]. В нашем исследовании была подтверждена неблагоприятная ассоциация носительства гомозиготного генотипа АА с развитием клинических проявлений синдрома ВПУ, при этом риск повышается в 1,73 раза.

Дополнительно в исследование был включен полиморфизм rs1544410 гена VDR. По данным литературы, недостаточность витамина D может быть связана с риском ССЗ и развиваться вследствие генетической изменчивости его рецептора [12]. При этом в нашем исследовании не было показано статистически значимых различий у пациентов с синдромом ВПУ и пациентов контрольной группы.

Заключение

Поиск молекулярно-генетических прогностических маркеров для формирования клинических проявлений и анатомического субстрата синдрома ВПУ является важной частью персонифицированной медицины и дает возможность ранней диагностики синдрома с целью прогнозирования течения заболевания. Были исследованы 5 ОНП, ассоциированных с развитием различных нарушений сердечного ритма и проводимости и дающие вклад в формирование проводящей системы сердца, 3 из которых не показали своей значимости в клинических проявлениях синдрома ВПУ. Однако по результатам исследования было выявлено, что генотип 5А/5А гена MMP3 снижает вероятность возникновения синдрома ВПУ в 2 раза, а генотип АА гена ММР9 повышает риск развития неблагоприятных сердечно-сосудистых проявлений в 1,73 раза.

В ходе установления связи между молекулярно-генетическими полиморфизмами при синдроме ВПУ будут расширены диагностические показатели и критерии прогноза данной патологии, возможность для осуществления скрининга определенного типа пациентов в группу риска развития сердечных аритмий. Будет определена пациентоориентированная диспансеризация для данной когорты пациентов. Значимость данной работы высока, т.к. углубляет знания о клинико-генетических маркерах синдрома ВПУ и сопутствующих данному синдрому нарушений сердечного ритма. Результаты проведённого исследования имеют важное значение и позволяют рекомендовать молекулярно-генетическую диагностику как скрининг-метод скрытой формы синдрома ВПУ. Расширение спектра генетических маркеров синдрома ВПУ может способствовать улучшению стратификации риска заболевания и целенаправленной и своевременной профилактики у пациентов с сердечно-сосудистой патологией. На основе создания генной сети для пациентов, имеющих признаки синдрома дисплазии соединительной ткани, возможностей идентификации в них "главных" генов и генов-модификаторов, анализа ассоциаций их ОНП с развитием АВРТ при синдроме ВПУ, будут разработаны диагностические системы/алгоритмы для проведения персонифицированной программы ранней диагностики предпосылок развития синдрома ВПУ в семьях больных с анатомическими изменениями сердечно-сосудистой системы, а также созданы предпосылки для разработки комплекса профилактических мероприятий.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.