Ассоциации rs1333049 ANRIL и rs10455872 гена LPА и клинических маркеров поражения сосудов у больных с наследственными дислипидемиями до 44 лет

Моногенные нарушения липидного обмена, вызывающие стойкое повышение уровня холестерина, приводят к раннему развитию ишемической болезни сердца (ИБС) и её коронарных осложнений [1]. Наиболее агрессивный атерогенез определяют гетерозиготная семейная гиперхолестеринемия (СГХ) и гиперлипопротеинемия(а) (гиперЛП(а)). Распространённость СГХ составляет 1:250 в европейских странах [2] и 1:173 в России; гиперЛП(а) обнаруживается у 2-3% населения [3][4]. Поэтому своевременное выявление больных, определение у них маркеров сердечно-сосудистого риска и ранний старт гиполипидемической терапии являются основой первичной профилактики атеросклероза и снижения сердечно-сосудистой смертности.

Изучение клинико-генетического статуса пациентов с гетерозиготной СГХ и гиперЛП(а) предполагает оценку вариантов однонуклеотидной последовательности генов, ассоциированных с сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) и метаболизмом липидов, и имеет прогностическое значение [5-7].

Ранний старт атеросклероза у больных с СГХ и гиперЛП(а) определяет интерес к полиморфизму rs1333049 некодирующей РНК (нкРНК) в локусе INK4 (ANRIL, Antisense Noncoding RNA in the INK4 Locus), который ассоциирован с инфарктом миокарда (ИМ) [8-10]. Так, в исследовании Ahmed W, et al. установлено, что носительство минорного аллеля rs1333049 (C) повышает риск ИБС на 15-20% в гетерозиготном и на 30-40% в гомозиготном состоянии [10].

Известно, что нкРНК относятся к нуклеиновым кислотам, не транслируются в белки, выполняют свои биологические функции на уровне РНК [11]: связываются с молекулярными мишенями, образуя регуляторные сети, которые инициируют специфические клеточные реакции, регулируют экспрессию генов, влияют на внутриклеточную сигнализацию и принимают участие в эпигенетических модификациях клеток [12].

На коротком плече хромосомы 9 (Chr9p21) расположен локус, наиболее значимо связанный с ИБС, ANRIL также находится в данном регионе [13]. Исследования генетики ИБС показали, что rs1333049 ANRIL тесно связан с развитием атеросклероза и его сосудистых осложнений [14][15]. Изучение ассоциаций генома у 15596 пациентов с ИБС и 34992 здоровых людей обнаружило, что локус хромосомы Chr9p21 имеет максимальное число мутаций, связанных с коронарным атеросклерозом [15][16]. Между тем, мы не встретили в литературе данных об изучении прогностического значения rs1333049 (C) у пациентов до 44 лет, т.е. у молодых людей (по новой классификации возрастных групп Всемирной организацией здравоохранения [17]) и у детей.

ГиперЛП(а) рассматривается как независимый фактор риска коронарных событий, rs10455872 в гене LPА (lipoprotein A gene) связан с повышенной концентрацией липопротеина(а) (ЛП(а)), риском неблагоприятных исходов ИМ, кальцификацией коронарных артерий и аорты [18][19].

Целью исследования стало изучение ассоциации однонуклеотидного варианта (ОНВ) rs1333049 ANRIL и rs10455872 гена LPA с показателями липидного спектра и состояния сосудистой стенки у пациентов с гетерозиготной СГХ и гиперЛП(а) для определения факторов неблагоприятного прогноза у пациентов до 44 лет и дополнительного обоснования раннего старта гиполипидемической терапии у пациентов с СГХ до 18 лет.

Материал и методы

Клиническое исследование одобрено локальным этическим комитетом (протокол № 128/2024 заседания локального этического комитета ФГБОУ ВО "КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого" Минздрава России) и проводилось в соответствии с положениями Хельсинкской декларации. Все участники (за детей до 15 лет — их законные представители) подписали добровольное информированное согласие.

Формирование целевых групп проведено путём селективного скрининга из медико-статистических баз липидного кабинета и сосудистых центров Краевой клинической больницы и больницы им. И. С. Берзона № 20. Родственники больных, перенесших сердечно-сосудистые события (ССС) до 55 лет — лица, не достигшие 44 лет — приглашались на обследование. Был выявлен 171 человек от 3 до 44 лет. В группу СГХ (61 человек) вошли дети до 16 лет, имеющие критерии Саймона Брума и пациенты старше 16 лет при наличии критериев DLCN (Dutch Lipid Clinic Network) [20]. Обследуемые с уровнем ЛП(а) >75 нмоль/л составили вторую группу. Контроль сформировали 74 человека с нормальными значениями липидограммы (табл. 1).

Рассматриваемые группы не имели статистических отличий по возрастно-половому составу, количеству обследуемых до 18 лет; включили 8 ядерных семей. У 37 пациентов (60,7%) диагноз был верифицирован как "определённая", в 39,3% случаев — "вероятная" СГХ.

Липидный профиль, включая аполипопротеин А1 (апоА1), аполипопротеин В (апоВ), ЛП(а) определялся иммунохемилюминесцентным методом на автоматизированной модульной платформе Roche Cobas 8000 с биохимическим модулем с702, "Roche Diagnostic".

Забор крови для определения rs1333049 и rs10455872 проводили из локтевой вены в вакуумные пробирки IMPROVACUTER (Guangzhou Improve Medical Instruments), содержащие раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты. Выделение геномной ДНК из 0,1 мл лейкоцитарной массы осуществляли сорбционным методом с помощью набора "ДНК-Сорб-B" (K1-2-100, "AmpliSens") согласно инструкции производителя. Выделенную ДНК хранили при температуре -80 °C.

Исследование носительства ОНВ проведено методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на аппарате Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Австралия) с использованием технологии аллельной дискриминации TaqMan (Taqman SNP Genotyping Assays) и флюоресцентных зондов Applied Biosystems (США) для rs10455872 (A/G) гена LPA, rs1333049 (C/G) ANRIL. В качестве буфера для ПЦР-РВ использовалась реакционная смесь "ПЦР-микс" (M-428, "Синтол"), содержащая 2,5-кратную реакционную смесь для проведения ПЦР-РВ, 25 мМ MgCl₂, ddH₂O. Распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Ультразвуковое исследование брахиоцефальных сосудов выполнялось в положении пациента лежа на спине: в В-режиме лоцировался дистальный сегмент общей сонной артерии (на 1,5-2,0 см проксимальнее ее бифуркации). Толщину комплекса интима-медиа (ТКИМ) измеряли автоматическим методом по задней стенке артерии, устанавливая курсор на границе адвентиция-медиа, второй — на границе интима/просвет сосуда. Оценка показателей проводилась с учётом возрастных нормативов [21].

Статистический анализ данных проводили в Excel и Statistica 12, параметрическими методами — данные представлены в виде средних, средних квадратических отклонений, достоверность различий между показателями принималась при p<0,05 критерия Манна-Уитни, корреляционный анализ изучен по коэффициенту Спирмена.

Результаты

Параметры липидного спектра показали максимальные уровни общего холестерина (ОХС) и липопротеинов низкой плотности (ЛНП) в 1 группе, и отсутствие различий между показателями в группе гиперЛП(а) с контролем (табл. 2).

Достоверность различий ЛП(а) в 1 группе не оценивалась из-за высокой вариабельности показателя — размах величин достиг 326 нмоль/л (от 0,9 до 326,9 нмоль/л).

Биологическая роль апоА1 и апоВ состоит в том, что первый является структурой липопротеинов высокой плотности и ассоциирован с клиренсом холестерина из клеток; второй находится на поверхности атерогенных частиц, поэтому увеличение его концентрации связано с повреждением сосудистой стенки и ИБС [22]. Значения апоА1 при СГХ были существенно ниже, чем в контроле, тогда как апоВ в обеих целевых группах значительно превысил показатель здоровых людей: при СГХ разница апоВ с контролем составила почти 100%.

Среди больных с СГХ (из 30 больных старше 18 лет) 11 пациентов имели 17 острых ССС (36,7%), средний возраст наблюдаемых на момент этих событий составил 35,9 года. В 8 случаях диагностирован ИМ, у 2 мужчин многососудистое стентирование коронарных артерий проведено в ходе диагностической коронарографии, и у 1 человека ИМ развился через 10 лет после ишемического инсульта, остальные 6 эпизодов — повторные чрескожные вмешательства.

В группе гиперЛП(а) число ССС было в 2,5 раза меньше: 3 случая ИМ, у 1 больного с выраженным кальцинозом коронарных артерий и аорты в 34 года одномоментно с чрескожным вмешательством проведена транскатетерная имплантация аортального клапана. У лиц с СГХ значение ТКИМ было существенно выше, чем в сравниваемых группах (<0,001).

Выявленное соотношение аллелей С и G ANRIL в контрольной группе не отличалось от полученного в крупном популяционном исследовании Восточной Сибири [16].

Частота генотипа CG ANRIL, определяющего 10-15% риск ССЗ, у пациентов с СГХ и гиперЛП(а) была достоверно выше, чем в контрольной группе (табл. 3).

Исследование ОНВ rs10455872 гена LPA показало абсолютное преобладание аллеля А в контрольной группе: частота аллеля G составила всего 0,6% (табл. 4). Аллель G был ассоциирован с более высоким уровнем ЛП(а), ранним началом ССЗ и худшим ответом на терапию статинами [19][20].

Соответственно, у обследуемых с нормальными показателями липидного метаболизма генотип АА гена LPA был преобладающим, а вариант GG не был выявлен ни в одной группе. Гетерозиготное носительство генотипа AG гена LPA достоверно чаще отмечалось у пациентов с гиперЛП(а).

Корреляционный анализ установил прямые умеренные корреляции между rs1333049 ANRIL и уровнем апоВ в обеих целевых группах (табл. 5), а также прямую умеренной силы ассоциацию с величиной ТКИМ сонных артерий. В контрольной группе выявлена положительная, умеренной силы зависимость ТКИМ с возрастом (0,303; р=0,004).

Выявлена важная особенность: AG генотип rs10455872 показал прямые, высоко значимые корреляции с уровнем апоВ и с ТКИМ у пациентов с СГХ, а также с ЛП(а) и ТКИМ у больных с гиперЛП(а).

Обсуждение

Поиск маркеров высокого сердечно-сосудистого риска у молодых людей и детей с наследственными дислипидемиями является остро актуальной проблемой, т.к. позволяет обосновать ранний старт гиполипидемической терапии с целью первичной профилактики развития ИБС. Исследование клинического значения ОНВ rs1333049 ANRIL и rs10455872 гена LPA в большинстве научных работ проведено у пациентов с ИБС, либо в больших популяционных группах [7-15]. Изучение ассоциаций ОНВ rs1333049 гена ANRIL и rs10455872 гена LPA с проявлениями атеросклероза у больных с СГХ и гиперЛП(а) от 3 до 44 лет проведено впервые.

Изучение клинико-биохимических и функциональных параметров установило, что уровень ОХС и ЛНП у больных с гиперЛП(а) не отличались от контрольных показателей. Но отмечалось статистически значимое увеличение апоВ в обеих целевых группах (СГХ и гиперЛП(а)), определившее весомый вклад апоВ в развитие поражения сосудистой стенки. Кроме того, при СГХ существенно сниженным оказалось значение апоА1, осуществляющего клиренс ЛНП из тканей.

Смысл этой комбинации отражает гистоморфометрическая картина: в работе Homma S, et al. [23] было обнаружено увеличение числа и плотности пенистых клеток в субэндотелии грудной аорты и коронарных артериях при низком уровне липопротеинов высокой плотности и высоком уровне ЛНП очень рано — у лиц 15-34 лет. Это согласуется с данными исследования Behbodikhah J, et al. [24], в котором апоВ и соотношение апоА1/апоВ рассматривались как терапевтические мишени у молодых людей с наследственными дислипидемиями. Клинико-генетическая неоднородность больных СГХ подчёркивает необходимость индивидуального подхода с учётом молекулярно-генетического статуса.

Снижение протективного влияния апоА1 и рост атерогенного апоВ у пациентов с СГХ обусловило выраженные изменения в сонных артериях: ТКИМ оказался значимо больше, чем в контроле и при гиперЛП(а). Соответственно, и ССС в данной группе встречались в 2,5 раза чаще, чем у лиц с гиперЛП(а). Необходимо отметить ранний старт ССС у наблюдаемых обеих групп — в 35,9 лет у пациентов с СГХ и в 35 лет у лиц с гиперЛП(а), что указывает на важность управления факторами риска у больных с семейными дислипидемиями на этапе до развития ИБС. Это также подчеркивается в работах, посвященных выявлению субклинических изменений с помощью ультразвукового исследования с целью снижения бремени атеросклероза, особенно, у детей и молодых людей с наследственными дислипидемиями [25-28].

Преобладание СG генотипа rs1333049 ANRIL у пациентов с СГХ и гиперЛП(а), а также его позитивная ассоциация с апоВ и ТКИМ в обеих целевых группах, по-видимому, определяет сценарий течения СГХ и гиперЛП(а) с ранним развитием атеросклероза и острых ССЗ. В нашем исследовании СG генотип rs1333049 ANRIL выявлен у 8 пациентов с ранними ССС на фоне СГХ, ещё более опасный вариант — СС генотип rs1333049 ANRIL, повышающий вероятность острых осложнений ИБС, обнаружен у двоих пациентов, и только у одного человека с перенесённым ИМ отмечался GG генотип.

Установлена значимая связь AG генотипа rs10455872 LPA с величинами апоВ и ТКИМ у пациентов с СГХ, а также корреляционная связь данного генотипа с уровнем ЛП(а) и ТКИМ в группе гиперЛП(а). При этом в контрольной группе данные генотипы были выявлены в небольшом проценте случаев без корреляционной связи с ультразвуковыми и биохимическими показателями.

Заключение

Изучение клинико-генетических взаимосвязей позволило установить следующие закономерности.

1. Пациенты с гетерозиготной СГХ до 44 лет характеризуются выраженными отклонениями липидного профиля с увеличением апоВ содержащих липидов, снижением уровня апоА1, ранним формированием изменений сосудистой стенки и ассоциацией данных изменений с (СG/СС) генотипом rs1333049 ANRIL. Существенный вклад в формирование атерогенных изменений в данной группе пациентов вносит AG генотип rs10455872 гена LPA. Данные особенности позволяют обсуждать вероятность реализации ССС в возрасте до 40 лет у 36,7% пациентов.
2. Семейную гиперЛП(а) отличают субнормальные значения стандартных показателей липидного профиля (ОХС и ЛНП). При этом у пациентов отмечается значимое повышение апоВ, существенное увеличение толщины внутреннего слоя сонных артерий, ассоциированное с высоким уровнем ЛП(а), (СG/СС) генотипом rs1333049 ANRILи AG генотипом rs10455872 гена LPA. Доля лиц с ранними (до 40 лет) острыми ССС в данной группе лиц достигает 15%.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.