Генетическая архитектура семейной гиперхолестеринемии на примере когорты жителей Санкт-Петербурга

Семейная гиперхолестеринемия (СГХС) — распространенное генетическое заболевание с аутосомно-доминантным типом наследования, характеризующееся повышением уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛНП) плазмы крови и высоким риском раннего развития сердечно-сосудистых заболеваний. Распространенность гетерозиготной СГХС в разных регионах России составляет от 1:108 до 1:173 [1]. В то же время 90% случаев СГХС как в мире, так и в России остаются недиагностированными, что подчеркивает необходимость внедрения эффективных программ скрининга СГХС [2].

Моногенные формы СГХС, как правило, обусловлены мутациями в генах рецептора ЛНП — LDLR (90%), аполипопротеина В — APOB (5-10%), пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 — PCSK9 (<1%) [3][4]. Генетическое тестирование СГХС дает возможность провести уточненную стратификацию сердечно-сосудистого риска: наличие патогенных вариантов увеличивает риск ишемической болезни сердца в 22 раза в популяции, а среди лиц с одинаковыми значениями ХС-ЛНП при выявлении патогенных вариантов риск повышается в 3 раза [2]. При этом тип патогенного генетического варианта является независимым предиктором недостижения целевых значений ХС-ЛНП [2]. Вероятность выявления генетической причины заболевания тем выше, чем более выражена клиническая картина (повышение уровня ХС-ЛНП, ксантоматоз, семейный анамнез), и у лиц с диагнозом "определенная СГХС" (>8 баллов по голландским диагностическим критериям) составляет 50-80% [5][6]. Так, в нашем предыдущем исследовании у пациентов с СГХС выявляемость составила 58% [7]. Секвенирование нового поколения (NGS) является основным подходом генетической диагностики СГХС, поскольку позволяет включить в анализ кодирующие области всех генов, при этом кроме канонических генов LDLR, APOB, PCSK9, международным консорциумом в настоящее время рекомендовано исследовать гены фенокопий СГХС (APOE (аполипопротеин Е), LDLRAP1 (адапторный белок для рецептора ЛНП), LIPA (лизосомальная кислая липаза), ABCG5 и ABCG8 (транспортеры стеролов)), для которых существуют отдельные терапевтические подходы [2][4][5]. В частности, нами и другими авторами в России недавно было описано несколько случаев ситостеролемии, связанной с патогенными вариантами в генах ABCG5, ABCG8 и имеющей клиническую картину схожую с СГХС [8].

Важно отметить, что у пациентов с предполагаемым диагнозом СГХС, у которых не удается обнаружить патогенные варианты в вышеперечисленных генах, заболевание может иметь полигенную природу [4]. Потому одним из востребованных подходов к увеличению предсказательной ценности генетического тестирования при СГХС является разработка шкал генетического риска (ШГР) на основе данных исследований по полно-геномному анализу ассоциаций (GWAS), которые могли бы учитывать суммарный вклад рисковых и протективных аллелей в генах, связанных с липидным обменом [9][10]. Таким образом ШГР может использоваться для прогнозирования индивидуального риска развития заболевания [11]. Проведение такого генетического тестирования на текущий момент не входит в клинические рекомендации, однако для полигенной гиперхолестеринемии были предложены различные варианты ШГР [9]. Наиболее часто используемой на данный момент является ШГР 6-SNP, включающая 6 полиморфных генетических вариантов, ассоциированных с уровнем ХС-ЛНП (rs629301 (CELSR2/SORT1), rs1367117 (APOB), rs4299376 (ABCG5/8), rs6511720 (LDLR), rs7412 и rs429358 (APOE)), продемонстрировавшая свою эффективность на нескольких европейских популяциях [12]. Как правило, ШГР помогает объяснить в среднем 20% всех случаев, когда не удается выявить патогенные варианты в генах СГХС [4][5]. В целом, опыт ведущих лабораторий, разрабатывающих решения для диагностики СГХС и других наследственных дислипидемий, показывает целесообразность учета маркеров полигенной СГХС в дизайне таргетной панели [4].

Нами была разработана таргетная панель, включающая расширенный список генов, ассоциированных с моногенными дислипидемиями, и ряд однонуклеотидных вариантов, связанных с полигенной гиперхолестеринемией и сердечно-сосудистым риском по данным GWAS. Цель настоящего исследования — определить частоту патогенных и вероятно патогенных вариантов, ассоциированных с СГХС, на ряду с оценкой доли полигенной СГХС согласно ШГР 6-SNP среди пациентов с диагнозом возможная/вероятная/определенная СГХС в Санкт-Петербурге.

Материал и методы

В исследование было включено 125 пациентов с диагнозом возможная/вероятная/определенная СГХС, которые наблюдались в ПСПбГМУ им. И. П. Павлова или Центре атеросклероза и нарушений липидного обмена на базе ФГБУ "СЗОНКЦ им. Л. Г. Соколова ФМБА" (табл. 1). Диагноз СГХС устанавливался на основании Голландских диагностических критериев [2]. Всем пациентам была проведена генетическая диагностика СГХС. Исследование выполнялось в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Исследование было одобрено Локальными этическими комитетами ПСПбГМУ им. И. П. Павлова и СЗОНКЦ им. Л. Г. Соколова. До включения в исследование у участников было получено письменное информированное согласие.

Генетическая диагностика проводилась в ПСПбГМУ им. И. П. Павлова. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови фенол-хлороформным методом. Библиотеки готовили с использованием набора реагентов Prep&Seq (Parseq Lab Co, Россия) и панели "Дислипидемия и риск ССЗ", включающей кодирующие регионы следующих генов: ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, ANGPTL3, APOA1, APOA4, APOA5, APOB, APOC2, APOC3, APOE, CETP, CREB3L3, GCK, СYP27A1, CYP7A1, GPD1, GPIHBP1, HNF1A, LCAT, LDLR, LDLRAP1, LIPA, LIPC, LIPG, LMF1, LPL, LRP6, MTTP, MYLIP, NPC1L1, PCSK9, PNPLA5, SAR1B, SCARB1, SORT1, STAP1, TTR, а также полиморфные маркеры rs629301, rs1367117, rs4299376, rs6511720, rs7412, rs429358 (VariFind LM assay IL-v1.1.1, Parseq Lab Co, Россия). Контроль качества библиотек был проведен с помощью Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, США) и Qubit (Thermo Fisher Scientific, США). Секвенирование проводили в режиме парных ридов 2*150 на секвенаторе MiSeq (Illumina, США). Данные секвенирования были обработаны автоматизированной программой Seq&Go Software (Parseq Lab Co, Россия). Выявленные генетические варианты были проаннотированы и описаны согласно рекомендациям the Human Genome Variation Society (HGVS) (www.hgvs.org). Для оценки клинической релевантности выявленных вариантов нуклеотидных последовательностей использованы базы данных OMIM, gnomAD, ClinVar, HGMD, LOVD и литературные данные. Оценка клинической значимости (патогенности) выявленных вариантов проводилась на основании российских рекомендаций для интерпретации данных, полученных методами массового параллельного секвенирования, а также рекомендаций ACMG2015. Верификация всех выявленных вариантов проводилась методом Сэнгера на секвенаторе Нанофор-05 (Синтол, Россия) с использованием набора реактивов BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), результаты анализировали с помощью программного обеспечения Mutation Surveyor (Soft Genetics, США). Значение ШГР 6-SNP рассчитывалось по взвешенной сумме рисковых аллелей, как описано ранее [12].

Результаты

На рисунке 1 представлены результаты распределения выявленных генетических факторов в зависимости от клинического диагноза пациентов (возможная/вероятная/определенная СГХС). Наибольшая выявляемость причинных генетических вариантов (66,7%) была отмечена, как и ожидалось, в подгруппе пациентов с определенной СГХС. В подгруппе с диагнозом возможная СГХС преобладали пациенты без патогенных генетических вариантов, но с высоким полигенным риском развития гиперхолестеринемии. В качестве критерия высокого полигенного риска принимали значения ≥0,79, что соответствует 80% процентилю, ранее рассчитанному для российской популяции [13]. Средние значения ШГР 6-SNP между исследуемыми группами не различались (0,73 (-0,22-0,93) для возможной, 0,73 (0,21-1,10) для вероятной, 0,73 (0,15-1,00) для определенной СГХС, p>0,05).

Список всех выявленных патогенных/вероятно патогенных вариантов, а также вариантов неопределенного клинического значения, представлен в таблице 2. Чаще всего у пациентов с СГХС выявляли варианты в гене LDLR (82,6% от всех выявленных патогенных и вероятно патогенных вариантов), в т.ч. в настоящей работе были обнаружены новые не описанные ранее варианты (табл. 2). Наиболее частый патогенный вариант в гене APOB c.10580G>A p.Arg3527Gln был выявлен у 6 пациентов (5%). Дисбеталипопротеинемия выявлена у 3 пациентов. Также было выявлено 4 гетерозиготных носителя патогенных вариантов (один из них носитель генотипа e2e2 гена APOE) и 5 носителей вариантов неопределенного клинического значения в генах ABCG5/ABCG8 (табл. 2). У одного из пациентов без патогенных вариантов в основных генах СГХС были выявлены 2 редких варианта в гене LDLRAP1: rs386629678 chr1:25563141_25563142delinsCA c.604_605delinsCA p.Ser202His, частота неизвестна; rs147242385 chr1:25566914C>T c.849C>T p.Tyr283=, частота 0,000055).

Обсуждение

Генетическая диагностика СГХС в настоящее время представляет определенные проблемы, т.к. не у всех пациентов с гиперхолестеринемией и ранним развитием сердечно-сосудистых заболеваний удается установить причину заболевания. Увеличению ценности генетического тестирования должно способствовать использование расширенных панелей для дифференциальной диагностики других дислипидемий, сходных по клиническим проявлениям с СГХС, развитие подходов к оценке полигенного риска заболевания, а также обследование семей и реклассификация вариантов неизвестного клинического значения.

В настоящей работе мы показываем эффективность применения новой диагностической NGS панели, которая позволяет проводить не только генодиагностику моногенной дислипидемии, включая рекомендованные гены, ассоциированные с СГХС и ее фенокопиями [2][4], но и вычислить значение наиболее используемой сегодня ШГР 6-SNP на основании носительства шести вариантов в генах липидного обмена LDLR, APOB, APOE, ABCG5/8 и SORT1 [5][6][11].

Ранее при использовании предложенной NGS панели для дифференциальной диагностики дислипидемий, нами был описан клинический случай ситостеролемии, обусловленной биаллельным носительством патогенных вариантов в гене ABCG8 [8]. В настоящем исследовании мы выявили четырех носителей патогенных вариантов в генах ABCG5 и ABCG8. Следует отметить, что вклад гетерозиготного носительства патогенных вариантов в генах ABCG5 и ABCG8 в развитие СГХС остается дискутабельным. Тем не менее варианты в этих генах могут предрасполагать к развитию полигенной СГХС, и, основываясь на результатах GWAS исследований, полиморфный вариант rs4299376 ABCG5/ABCG8 был включен в ШГР 6-SNP. Транспортеры стеролов ABCG5 и ABCG8 с тканеспецифичной экспрессией в печени и кишечнике участвуют в регуляции всасывания холестерина в кишечнике и выведении его через желчь. Среди атерогенных дислипидемий можно также выделить семейную дисбеталипопротеинемию, частота которой, вероятно, недооценена и по последним данным составляет 0,5-0,8% (1 на 118-184) в европейском регионе России [13]. В нашем исследовании выявлены 2 пациента с генотипом e2e2 и один пациент с вариантом p.Arg154Cys в гене APOE. Выявление таких вариантов позволило своевременно инициировать патогенетическое лечение пациентов с использованием эзетимиба в случае ситостеролемии, комбинации статинов и фенофибрата — для пациентов с дисбеталипопротеинемией.

В нашем исследовании варианты в канонических сайтах сплайсинга составили 3,4%, в основном все они были ранее описаны у российских пациентов с СГХС [3][14]. Выявленный нами новый вариант c.190+2T>C расположен в донорном сайте интрона 2, ранее описанные варианты в данном сайте c.190+1G>A, c.190+2T>G и 190+4A>T классифицированы как вероятно патогенные. Патогенные и вероятно патогенные варианты нарушения сплайсинга мРНК могут составлять по разным оценкам от 9% до 25% от всех мутаций, однако для доказательства их патогенности требуются дополнительные исследования [14].

В целом ~47% вариантов классифицируются как варианты неопределенного клинического значения, из-за отсутствия достаточных доказательств их связи с заболеванием/фенотипом, отсутствия функциональных исследований, а некоторые варианты были описаны только единожды [2]. Реклассификация вариантов неопределенного клинического значения имеет важное значение. Как показывает практика, в случае генов APOB и PCSK9 такие варианты в большинстве случаев не влияют на функцию рецептора ЛНП и маловероятно вызывают заболевание. В то же время ~50% вариантов неопределенного клинического значения в гене LDLR впоследствии переклассифицируются в патогенные и вероятно патогенные при появлении новых данных [5]. В настоящее время для оценки патогенности также можно воспользоваться данными, полученными в результате моделирования молекулярной структуры белка рецептора ЛНП [15]. Так, например, нами выявлен семейный случай СГХС, ассоциированный с вариантом неопределенного клинического значения c.1366C>T p.Leu456Phe в гене LDLR. По данным моделирования in silico данная аминокислотная замена приводит к нарушению структуры и функции рецептора ЛНП [15].

В настоящем исследовании патогенные и вероятно патогенные варианты закономерно кластеризуются в подгруппе пациентов с определенной СГХС (рис. 1), для которых характерно более значимое повышение уровня ХС-ЛНП и более выраженная клиническая картина, а пациенты с высоким значением полигенного риска преобладают в подгруппе в возможной СГХС, предполагая больший вклад полигенного компонента. Аналогичные результаты были получены в работе Rieck L, et al., основным драйвером развития заболевания у пациентов с определенной СГХС являются патогенные и вероятно патогенные генетические варианты [6]. Несмотря на то, что полигенный фон может модулировать пенетрантность моногенных вариантов, в этой области требуются дальнейшие исследования [2][12]. Следует отметить, что предложенные в настоящее время ШГР обладают ограниченной клинической эффективностью по следующим причинам: 1) небольшой размер первоначальных исследований GWAS, что повлияло на точность оценки влияния отдельных вариантов на риск заболевания; 2) ограниченные вычислительные методы для создания ШГР; 3) отсутствие больших наборов данных, необходимых для тестирования и валидации ШГР; 4) необходимость учитывать популяционные особенности [9][10]. По результатам исследований, проведенных в последнее время, рядом авторов было высказано предположение, что редкие рисковые аллели кластеризуются внутри семей, однако в настоящее время такие данные немногочисленны ввиду сложности получения биоматериала в обширных родословных [6][10]. Таким образом, будущие исследования должны оценить прогностическую значимость различных ШГР, учитывающих как частые полиморфные варианты, так и редкие варианты, для оценки риска развития дислипидемии и сердечно-сосудистых осложнений.

Ограничения исследования. Небольшой размер выборки и, поскольку пациенты набирались в специализированных центрах, превалирование в выборке пациентов с диагнозом "определенная СГХС", использование ШГР с небольшим набором вариантов нуклеотидной последовательности.

Заключение

Использование расширенной NGS панели, включающей гены наследственных дислипидемий, а также локусы для расчета ШГР, может быть критически важным как для проведения дифференциальной диагностики, так и для выявления групп с полигенной природой гиперхолестеринемии. Данный подход имеет ключевое значение для определения этиологии гиперхолестеринемии, а кроме того, может быть использован для персонализации подходов к лечению, т.е. для выбора препаратов и усиленного контроля дозировок, а также как основание для ранней профилактики.

Следует, однако, отметить, что в настоящее время полигенная оценка риска пока ещё не является надежным инструментом клинической практики. Дальнейшие исследования позволят предложить использование ШГР для скрининга общего риска сердечно-сосудистых заболеваний и, возможно, предоставят дополнительную информацию для пациентов с высоким риском с известной моногенной причиной.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.