Полиморфизм генов воспалительного ответа, эндотелиальной дисфункции, липидного обмена и окислительного стресса у пациентов с ишемической болезнью сердца

Ишемическая болезнь сердца (ИБС), являющаяся многофакторным заболеванием со значительным вкладом генетической составляющей — одна из ведущих патологий сердечно-сосудистого континуума во всем мире [1]. Известно, что основной патогенетической причиной развития ИБС является атеросклероз, характеризующийся хроническим воспалением, а также накоплением липидов в сосудистой стенке [2]. Наряду с традиционными факторами риска, такими как курение, диабет, гиперхолестеринемия и артериальная гипертензия, установлено, что вклад наследуемости в развитие ИБС составляет от 40 до 60% [3][4]. На сегодняшний день, благодаря проведенным полногеномным ассоциативным исследованиям (Genome-Wide Association Studies — GWAS) продемонстрировано, что с ИБС связано ~396 однонуклеотидных полиморфизмов. Среди ключевых генов можно отметить такие как APOA5, PCSK9, GUCY1A1, NOS3, ANGPTL4, LDL-R, APOC3, LPL и LPA, участвующие в регуляции уровня липидов, воспаления, сосудистого гомеостаза и артериального давления [5].

Повышенный уровень холестерина в крови, в частности, липопротеинов низкой плотности, является одним из ключевых факторов риска ИБС. Практически 20% полиморфных вариантов, ассоциированных с риском развития данной патологии, расположены вблизи последовательностей генов, участвующих в регуляции липидного обмена [5]. В последнее десятилетие отдельное внимание уделяется также роли иммунитета и воспаления в патогенезе ИБС, что стало особенно актуальным после проведения исследования CANTOS, которое продемонстрировало эффективность противовоспалительной терапии канакинумабом при лечении патологий сердечно-сосудистой системы [6]. В ряде исследований также установлены ассоциативные связи генов IL1, IL6 и IL17 с повышенным риском развития ИБС [7][8].

Известно, что развитию атеросклероза и его осложнений предшествует эндотелиальная дисфункция, характеризующаяся дисбалансом в продукции молекул монооксида азота (NO), которые вырабатываются эндотелием сосудов, результатом чего является нарушение вазодилататорной реакции и приобретение эндотелием протромботического и провоспалительного фенотипа [9]. Таким образом, современные исследования сосредоточены на поиске новых маркеров и разработке терапевтических подходов, которые будут направлены на профилактику эндотелиальной дисфункции, что позволит снизить риск развития атеросклероза и связанных с ним осложнений, в т.ч. ИБС. Целью исследования явилась оценка вовлеченности однонуклеотидных полиморфных вариантов генов воспалительного ответа, эндотелиальной дисфункции, липидного обмена и окислительного стресса в развитие ИБС.

Материал и методы

В ретроспективное одноцентровое исследование включено 260 пациентов с установленным диагнозом стабильная ИБС (209 мужчин и 51 женщина) и 300 условно-здоровых доноров (110 мужчин и 190 женщин). Диагноз ИБС установлен в соответствии с национальными рекомендациями Всероссийского научного общества кардиологов по диагностике и лечению стабильной стенокардии, а также подтвержден клиническими, анамнестическими и инструментальными методами (коронарография, стеноз коронарных артерий >50%) исследования. В группу контроля включались участники без какой-либо сердечно-сосудистой патологии. Медиана возраста условно здоровых доноров составила 53 (21;80) года. Полная клиническая характеристика исследуемых пациентов с ИБС представлена в таблице 1. Исследование одобрено локальным этическим комитетом НИИ КПССЗ (г. Кемерово) и выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации.

Материалом для исследования послужила периферическая кровь, собранная из локтевой вены в пробирки, содержащие К3ЭДТА (для молекулярно-генетического анализа) и активатор свертывания (для иммуноферментного анализа).

Сывороточные уровни интерлейкина-1b (IL1b) (кат. номер BMS224-3, Thermo Scientific), CRP (кат. номер BMS288INST, Thermo Scientific), эндотелиальной синтазы азота (eNOS) (кат. номер DY950-05, RnD Systems), Endothelin-1 (кат. номер DET100, RnD Systems) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа коммерческими наборами в соответствии с протоколами производителей. Детекцию результатов проводили на спектрофотометре Multiskan Sky (Thermo Scientific, США).

Геномную ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Качество и количество полученных образцов оценивали на приборе NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США). Для исследования отобрано 42 полиморфных варианта 24 генов кандидатов, представленных в таблице 2. Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по технологии TaqMan на приборе Viia 7 (Applied Biosystems, США).

Результаты, полученные в ходе исследования, обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Количественные данные представляли в виде медианы (Me) и квартилей (Q1; Q3). Для сравнения значений признака в двух или более группах использовали критерии Манна-Уитни или Краскела-Уоллиса, соответственно. Статистический анализ результатов генотипирования осуществляли посредством онлайн-программы SNPstats (http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats). Анализ межгенных взаимодействий проводили в программе MDR v.3.0.2. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Для всех полиморфных вариантов генов, включённых в исследование, распределение частот генотипов не имело отклонений от равновесия Харди-Вайнберга. Статистически значимые ассоциации полиморфных вариантов генов с предрасположенностью к развитию ИБС получены только для шести аллельных вариантов, представленных в таблице 3. Установлено, что носительство редкого аллеля как в гомозиготном, так и в гетерозиготном варианте генотипа по полиморфным вариантам rs3093077-А гена CRP, rs1799983-Т гена NOS3 и rs5370-Т гена EDN ассоциировано с развитием ИБС. Также определено, что гомозиготные генотипы T/T rs1205 гена CRP (p=0,043) и G/G rs1137100 гена LEPR (p=0,037) статистически значимо ассоциированы с развитием ИБС по рецессивной модели наследования, а генотипы A/G и A/A rs16944 гена IL1B по доминантной модели наследования.

При анализе гаплотипов исследуемых генов установлено, что 2 гаплотипа rs16944A-rs1205T-rs3093077C-rs5370G-rs1799983G-rs1137100A (р=0,04) и rs16944A-rs1205T-rs3093077C-rs5370G-rs1799983Т-rs1137100A (р=0,032) показали выраженную взаимосвязь с предрасположенностью к развитию ИБС (табл. 4).

С использованием программы MDR 3.0.2 установлено 3 наиболее значимые модели межгенных взаимодействий (одна двухлокусная, одна четырехлокусная и одна шестилокусная) (табл. 5). На рисунке 1 представлен граф межгенных взаимодействий, визуализирующий их характер. Показано, что наибольший вклад в развитие ИБС вносят полиморфные варианты rs3093077 гена CRP (14,94%) и rs1799983 гена NOS3 (4,05%). Для следующих пар полиморфных вариантов генов характерен выраженный антагонистический эффект (линии синего цвета): rs1799983 (NOS3) — rs16944 (IL1B) (-2,35% энтропии); rs1799983 (NOS3) — rs3093077 (CRP) (-1,52% энтропии); rs1799983 (NOS3) — rs5370 (EDN) (-2,35% энтропии); rs5370 (EDN) — rs16944 (IL1B) (-1,50% энтропии); rs5370 (EDN) — rs3093077 (CRP) (-2,45% энтропии). Для полиморфизмов rs1205 гена CRP и rs1137100 гена LEPR (0,74% энтропии) показан умеренно выраженный синергический эффект (линии оранжевого цвета).

Следующим этапом исследования стало изучение взаимосвязи сывороточных уровней белков IL1b, CRP, eNOS и эндотелина-1 с полиморфными вариантами генов IL1B, СRP, EDN и NOS3. Сравнительный анализ позволил установить единственную ассоциацию для полиморфного варианта rs3093077 гена CRP. Выявлено, что носители аллеля А варианта rs3093077 гена CRP характеризовались более высокими значениями концентрации С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке (табл. 6).

Обсуждение

Риск развития ИБС зависит от комплекса взаимовлияющих традиционных факторов риска и генетической составляющей. Проведенные на сегодняшний день генетические исследования демонстрируют вовлеченность в патогенез ИБС генов, регулирующих липидный и углеводные обмены, функцию эндотелия (поддержание сосудистого гомеостаза), участвующих в поддержании системы коагуляции и иммунной системы [10]. Воспаление играет важную роль на каждом этапе прогрессирования ИБС, начиная от эндотелиальной дисфункции и заканчивая развитием острых коронарных событий, и является одним из ключевых факторов патогенеза данного заболевания [11]. Согласно литературе, показана взаимосвязь сывороточных концентраций провоспалительных цитокинов, а также ассоциации некоторых однонуклеотидных полиморфных вариантов генов, ответственных за воспалительный ответ, с риском развития ИБС, однако имеющиеся данные носят противоречивый характер [12]. В нашем исследовании выявлено три полиморфных варианта, увеличивающих риск развития ИБС в среднем в два раза: IL1B rs16944, CRP rs1205 и CRP rs3093077. IL1b — провоспалительный цитокин, регулирующий множество физиологических сигналов, которые являются ключевыми составляющими воспалительных реакций [13]. Продемонстрировано, что IL1b занимает одно из ключевых мест в атерогенезе и прогрессировании ИБС [14]. Ген IL1B, кодирующий белок IL1b, располагается в регионе 2q14.1. Наиболее изучаемыми полиморфными вариантами данного региона являются варианты rs16944 и rs1143634, влияющие на экспрессию мРНК и белка [15]. В нашем исследовании проанализированы оба аллельных варианта, однако только для полиморфизма rs16944 получены статистически значимые ассоциации с риском ИБС. Данные литературы демонстрируют наличие ассоциаций варианта rs16944 с такими заболеваниями, как рак легких, ревматоидный артрит, инфаркт миокарда и ИБС [16]. Кроме провоспалительных цитокинов, также отмечена роль острофазного СРБ, вырабатываемого гепатоцитами и эндотелиальными клетками под воздействием интерлейкина-6, IL1b и фактора некроза опухоли, в патогенезе сердечно-сосудистых катастроф, в т.ч. и ИБС [17]. В исследованиях отмечается, что повышение уровня СРБ в сыворотке крови может быть ассоциировано с определенной комбинацией генотипов полиморфных вариантов гена CRP [18]. Стоит отметить, что в нашем исследовании уровни сывороточного СРБ были связаны с генотипами полиморфного варианта rs3093077 гена CRP, однако для полиморфизма rs1205 этого же гена подобной закономерности получено не было.

Нарушение баланса между выделяемыми вазоконстрикторами и вазодилататорами, в первую очередь за счет нарушения метаболизма NO и снижения его биодоступности, может быть причиной дисфункции эндотелия [19]. Установлено, что аллельные варианты гена, кодирующего eNOS, ассоциированы с развитием ИБС и ее клиническими проявлениями, однако данные исследователей противоречивы [20]. Так, для полиморфных вариантов rs1799983 и rs2070744 гена NOS3 не установлено ассоциаций со стабильной стенокардией, а также с острым коронарным синдромом [21][22]. Полиморфный вариант rs1799983 гена NOS3 располагается в 7 экзоне и приводит к замене в 894 позиции гуанина на тимин. Исследования демонстрируют, что наличие аллеля Т связано со снижем уровня экспрессии гена NOS3, что, в свою очередь, приводит к снижению его вазопротекторного действия и повреждению эндотелия [20]. Нами также выявлен рисковый эффект аллеля Т в отношении развития ИБС, однако не было установлено ассоциаций между сывороточными уровнями eNOS и носительством рисковых генотипов полиморфизма rs1799983 гена NOS3. В противоположность NO, эндотелин-1 является одним из важнейших вазоконстрикторов. Его функция также заключается в поддержании сосудистого гомеостаза, а повышенная экспрессия данного белка может быть ассоциирована с нарушением гомеостатического баланса, что впоследствии способно приводить к неблагоприятным патологическим событиям [23]. Литературные данные демонстрируют, что полиморфные варианты гена EDN, кодирующего эндотелин-1, ассоциированы с развитием ИБС в различных популяциях [24-26]. Нами выявлен аллель Т, рисковый эффект которого реализован через гомозиготный генотип Т/Т, увеличивающий риск развития ИБС в 2 раза.

Помимо воспаления и эндотелиальной дисфункции, еще одним не менее важным звеном патогенеза ИБС является нарушение липидного обмена, характеризующееся отложением холестерина и атерогенных липопротеинов в сосудистой стенке [27]. Исследования последних лет показали, что уровень холестерина и липопротеинов низкой плотности напрямую коррелируют с тяжестью ИБС [28]. В нашем исследовании мы провели сравнительной анализ четырех генов, вовлеченных в липидный обмен (APOE, APOB, LPA и LIPC), а также генов, которые также могут быть связаны с метаболизмом липидов (INS, LEP и LEPR), и выявили только одну ассоциацию с риском развития ИБС для полиморфного варианта rs1137100 гена LEPR, кодирующего рецептор лептин. Лептин — плейотропный гормон, секретируемый адипоцитами и участвующий во многих биологических процессах, таких как воспаление, иммунный ответ, ангиогенез, поддержание сосудистого гомеостаза [29]. Увеличение уровня лептина в сыворотке крови (гиперлептинемия) ассоциировано с сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, гипертонией и ИБС [29][30]. Реализация биологического эффекта лептина происходит при связывании последнего с его специфическими рецепторами, которые распространены в центральной нервной системе и периферических органах и тканях [31]. Ген LEPR располагается в регионе 1p31.3 и состоит из 20 экзонов и 19 интронов [32]. Полиморфизм rs1137100 гена LEPR способен влиять на функциональную активность рецептора лептина, изменяя его связывающую способность и передачу сигнала.

Ограничения исследования. Несмотря на проведение исследования в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики, в проведенном исследовании имеется ряд ограничений: одноцентровость и ограниченность выборки, отсутствие средних популяционных значений для сывороточного содержания исследуемых маркеров, отсутствие на данном этапе исследования данных обследования лиц из группы контроля.

Заключение

Таким образом, проведённое исследование демонстрирует значительный вклад полиморфных вариантов генов воспалительного ответа (IL1B rs16944, CRP rs1205 и CRP rs3093077), эндотелиальной дисфункции (EDN rs5370 и NOS3 rs1799983) и липидного обмена (LEPR rs1137100) в формирование предрасположенности к развитию ИБС.

Отношения и деятельность: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.