Внеклеточные нуклеиновые кислоты как биомаркеры сердечно-сосудистых заболеваний: перспективы и ограничения

Согласно данным исследования Global Burden of Diseases, Injuries and Risk Factors с 1950 по 2021гг продолжительность жизни во всем мире увеличилась на 22,7 лет благодаря усовершенствованию методов диагностики и лечения, увеличению доступности медицинской помощи [1]. Несмотря на успехи здравоохранения, смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) составляет 1/3 от всех причин летальности [2], и в Российской Федерации, США и Европейских странах достигает 850 тыс., 4 млн, и 697 тыс. человек в год, соответственно [3].

Наиболее встречающиеся ССЗ — ишемическая болезнь сердца (ИБС), являющаяся основной причиной смертности, гипертоническая болезнь, сердечная недостаточность (СН), фибрилляция предсердий, ревматическая болезнь сердца, кардиомиопатии, воспалительные заболевания эндокарда и миокарда [4].

К основным факторам риска развития ССЗ относятся возраст, пол, дислипидемия, артериальная гипертензия (АГ), неправильное питание, гиподинамия, хроническая болезнь почек, сахарный диабет (СД), риск тромбообразования, в т. ч. связанный с курением [5]. Дополнительными факторами риска являются этническая принадлежность, избыточные стрессовые факторы, тревожно-депрессивные расстройства, низкий социально-экономический статус и социальная поддержка [6]. За последние десятилетия значимо возросла заболеваемость ССЗ среди лиц от 18 до 39 лет ввиду роста вышеперечисленных факторов риска [7]. К 2050г ожидается дальнейший рост распространенности ССЗ во всех возрастных группах [8]. Актуальной задачей является поиск ранних и специфических маркеров ССЗ с целью стратификации риска развития ССЗ, разработки методов профилактики, ранней диагностики и лечения.

В последние десятилетия значительное внимание уделяется внеклеточным нуклеиновым кислотам в плазме крови: свободноциркулирующей внеклеточной ДНК (св-ДНК) [9] и циркулирующим некодирующим РНК [10], рассматривающиеся как перспективные прогностические и диагностические биомаркеры многих патологических состояний, т. к. они играют ключевую роль в регуляции физиологических и патофизиологических процессов, в т. ч. при ССЗ [10].

В статье представлен обзор современных представлений о свободноциркулирующих нуклеиновых кислотах (св-ДНК и микроРНК) в качестве потенциальных биомаркеров для диагностики, стратификации риска, оценки тяжести и мониторинга течения ССЗ, с акцентом на ИБС, хроническую СН (ХСН) и отторжение сердечного аллографта, где эта область исследований является многообещающей.

Методология исследования

Поиск литературных источников проводился в научных базах данных PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/), eLIBRARY.RU (https://elibrary.ru/), Embase (embase.com), Web of science (https://www.webofscience.com), Google Scholar (scholar.google.com) за период 2004-2024гг на основе сочетаний ключевых слов и их комбинаций: "внеклеточная ДНК", "малые некодирующие РНК", "микроРНК", "сердечно-сосудистые заболевания", "острый коронарный синдром", "ишемическая болезнь сердца", "инфаркт миокарда", "сердечная недостаточность", "артериальная гипертензия", "трансплантация сердца", "отторжение сердечного аллографта".

Результаты

Свободноциркулирующая внеклеточная ДНК

Св-ДНК образуется в результате апоптоза, приводящего к высвобождению более мелких фрагментов (60-500 п. н.), или некроза, обуславливающего высвобождение более крупных фрагментов (~10000 п. н.). В течение короткого времени она циркулирует в различных жидкостях организма [11] и может быть детектирована в плазме крови и других биологических жидкостях [12]. Механизмы, лежащие в основе утилизации св-ДНК, включают удаление макрофагами фрагментов св-ДНК из кровотока, поглощение ретикулоэндотелиальной системой печени и селезенки, а меньшая роль отводится фильтрации почечной системой и прямой деградации нуклеазами [13]. Время полувыведения св-ДНК из плазмы крови колеблется от 16 мин до 2 ч [14].

У здоровых людей большинство св-ДНК происходит из клеток костного мозга и крови, эндотелиальных клеток и гепатоцитов [15], физиологическая концентрация св-ДНК в плазме крови может колебаться в широком диапазоне от 1 до 16,8 нг/мл [16]. Повышение количества св-ДНК в кровотоке наблюдается при различных патофизиологических состояниях (при опухолевом росте, некрозе, апоптозе клеток) [17].

Выявлено, что у женщин в постменопаузе, не получающих заместительную гормональную терапию, повышение уровня св-ДНК коррелировало с уровнем артериального давления, жесткостью сосудистой стенки, изменением концентрации С-реактивного белка, интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли альфа, нарушением метаболизма глюкозы [18].

Kananen L, et al. (2022) изучили уровень св-ДНК в плазме крови 5385 человек в возрасте от 17 до 82 лет в зависимости от наличия бронхиальной астмы, хронической обструктивной болезни легких, артрита, остеопороза, СН, стенокардии, АГ, СД, онкологических заболеваний, инфаркта миокарда (ИМ), острого нарушения мозгового кровообращения, а также от расчетного "индекса хрупкости", ассоциирующегося с риском неблагоприятных исходов [19]. Уровень св-ДНК был выше у мужчин, у курильщиков, а также у пожилых, более "хрупких" пациентов, не зависел от количества сопутствующих заболеваний. Положительная корреляция уровня св-ДНК была выявлена с С-реактивным белком, интерлейкином-6 и 3-гидроксибутиратом [19].

Свободноциркулирующая внеклеточная ДНК при ИБС

Активно проводятся исследования, посвященные изучению взаимосвязи уровня св-ДНК в плазме крови при острых формах ИБС: ИМ и острый коронарный синдром (ОКС). Св-ДНК может аутокринным и паракринным путем активизировать процессы воспаления миокарда, способствуя прогрессированию систолической и диастолической дисфункции [20].

Сравнительный анализ содержания св-ДНК в плазме крови пациентов с ОКС (n=137), со стабильной стенокардией напряжения (n=13), здоровых добровольцев (n=60) выявил, что наиболее высокий уровень св-ДНК (2285,0 нг/мл [ 916,4;4857,3]) был характерен для пациентов с ОКС, промежуточное значение (202,3 нг/мл [ 112,7;256,1]) — для пациентов со стабильной стенокардией и самый низкий (118,3 нг/мл [ 81,1;221,1]) — для здоровых добровольцев (p<0,05) [21]. Содержание св-ДНК при нестабильной стенокардии составляло 802,1 нг/мл, без подъема сегмента ST (ОКСбпST) увеличивалось до 2725,9 нг/мл, а при подъеме сегмента ST достигало 5745,4 нг/мл, соответственно (p<0,05) [21]. Более высокое содержание св-ДНК в плазме крови ассоциировалось с более высоким риском неблагоприятных событий по шкале GRACE при ОКС: в группах низкого (<100 баллов) риска уровень св-ДНК составил 1791,9 [ 1197,9;3648,6] нг/мл, высокого (100-200 баллов) — 2635,1 [ 2344,9;5219,9] нг/мл, и очень высокого риска (>200 баллов) — 8161,8 [ 2688,3;9205,7] нг/мл (p<0,001). Отмечено, что уровень св-ДНК снижался через 7 дней после ОКС [21].

В группе пациентов с ИМ концентрация св-ДНК в плазме была значительно выше, чем у пациентов из контрольной группы (медиана 1,6% для ИМ vs 0% для контрольной группы) [22]. Значения св-ДНК сохранялись повышенными у пациентов с ИМ, несмотря на выполненные чрескожные коронарные вмешательства, снижаясь на 2 сут. после вмешательства. Одновременно наблюдалась схожая динамика уровней св-ДНК и высокочувствительного тропонина у пациентов с ИМ. Дополнительно у 95% пациентов с ИМ в св-ДНК было обнаружено метилирование локуса СORO6, кодирующего актин-связывающий белок, который высоко экспрессируется в скелетных мышцах и сердце, играет важную роль в регуляции кластеризации ацетилхолиновых рецепторов в скелетных мышцах. При этом низкий уровень метилирования локуса СORO6 в св-ДНК был характерен для пациентов с колоректальным раком, гепатоцеллюлярной карциномой и здоровых добровольцев (3,9%, 9,5% и 3%, соответственно), что свидетельствовало о кардиоспецифичности данного маркера [22].

В группе пациентов с ИМ уровень св-ДНК был значительно выше, чем у пациентов из группы риска по развитию ИМ, при этом исследованные группы не различались по возрасту, наличию других факторов риска: АГ, СД, дислипидемии и курению [23].

В исследовании Cuadrat RRC, et al. (2023) уровень св-ДНК у пациентов с ИМ достигал 60,65 нг/мл и статистически отличался от 2,68 нг/мл здоровых добровольцев [24]. По сравнению со здоровыми уровень св-ДНК был выше у пациентов с ИМ с подъемом сегмента ST (р=0,0001), ИМ без подъема сегмента ST (р=0,0003) и нестабильной стенокардией (р=0,0006), но различий в уровнях св-ДНК между этими формами острой ИБС выявлено не было (р>0,05) [24]. У пациентов с ИМ уровень св-ДНК отрицательно коррелировал с фракцией выброса (ФВ) левого желудочка (ЛЖ) и положительно — с креатинфосфокиназой, корреляция с уровнем тропонина крови в данном исследовании практически отсутствовала [24].

В проспективном когортном исследовании, включавшем 98 пациентов с ИМ, выявлена положительная корреляция высоких значений св-ДНК (выше медианного уровня — 14,39 нг/мл) с повышенным уровнем сердечного тропонина I (r=0,377, p<0,001) и растворимого белка подавления онкогенности 2 (sST2) (r=0,443, p<0,001) [25]. Кроме того, более высокий уровень св-ДНК (выше порогового значения: 9,227 нг/мл) был предиктором риска развития СН после ИМ (индекс C =0,74, 95% доверительный интервал (ДИ): 0,733-0,748).

Согласно данным крупного метаанализа (2023), в 17 исследованиях (n=1804) было выявлено статистически значимое повышение уровня св-ДНК у пациентов с ИМ по сравнению с контрольной группой (суммарный SMD 3,47 (95% ДИ: 2,54-4,41, p<0,001)). Также было высказано предположение, что более высокие значения св-ДНК у пациентов с ИМ коррелируют с неблагоприятными клиническими событиями (развитие СН, повторный ИМ). Гетерогенность этих исследований была высокой (I²=98%, p<0,001), что затрудняет проведение общих выводов о диагностическом потенциале св-ДНК [26].

В исследовании Заиграева И. А. с др. (2024) у пациентов с ОКС с подъемом сегмента ST содержание св-ДНК не отличалось до и через 24 ч после выполнения стентирования коронарных артерий. Однако уровень св-ДНК был ассоциирован с большей протяженностью стентированного сегмента и количеством стентов и риском выявления нарушений локальной сократимости [27].

Свободноциркулирующая внеклеточная ДНК при других заболеваниях сердечно-сосудистой системы

Существенное повышение концентрации св-ДНК плазмы было выявлено у пациентов с АГ умеренного, высокого и очень высокого риска по сравнению со здоровыми добровольцами вне зависимости от длительности АГ: 227 [ 110;370] копий ДНК/мл и 88 [ 62;116] копий ДНК/мл, соответственно [28].

У пациентов с ХСН наблюдалось резкое повышение уровня св-ДНК до ~1500 нг/мл по сравнению со здоровыми добровольцами, у которых уровень колебался в пределах 10-50 нг/мл [20]. В исследовании Salzano A, et al. (2020) у пациентов со стабильной ХСН с ФВ ЛЖ <50% уровень св-ДНК был в 6 раз выше 19,4 [ 11,1;41,7] нг/мл, чем у здоровых добровольцев 3,4 [ 2,0;6,1] нг/мл (p<0,001). Обнаружена корреляция между содержанием св-ДНК и функциональным классом ХСН (r=0,294, p=0,017) и отсутствие таковой с полом, возрастом и эхокардиографическими показателями. Установлена ассоциация между показателем св-ДНК и числом декомпенсаций ХСН, летальностью в течение 30 мес. [29].

В проспективном наблюдательном исследовании выявлена статистически значимая обратная корреляция между уровнем св-ДНК и ФВ ЛЖ [30]. У пациентов с низкой ФВ ЛЖ (<40%) уровень св-ДНК был значительно выше (634,7±25,8 нг/мл), чем у пациентов с сохраненной ФВ ЛЖ (≥50%) — 113,1±7,3 нг/мл [30]. Обнаружена прямая умеренная связь концентраций св-ДНК и N-концевого промозгового натрийуретического пептида в подгруппе пациентов с ФВ ЛЖ <40% (ρ=0,39), которая отсутствовала в подгруппах сохранённой и промежуточной ФВ ЛЖ (ρ=0,19). При контроле лабораторных показателей через 6 мес. у пациентов с низкой ФВ ЛЖ (<40%) на фоне квадротерапии ХСН наблюдалось значимое снижение св-ДНК (555,7±41,7 → 384,07±26,6 нг/мл) и N-концевого промозгового натрийуретического пептида (1456,9±187,9 → 908,6±137,1 пг/мл) [30].

Свободноциркулирующая внеклеточная ДНК как маркер отторжения трансплантированного сердца

В качестве возможной альтернативы эндомиокардиальной биопсии (ЭМБ) исследуется свободноциркулирующая ДНК донорского происхождения (св-дДНК), которая высвобождается из поврежденных клеток аллографта и может быть детектирована в плазме крови реципиента.

В многоцентровом исследовании (2019), включавшем 740 реципиентов, определение уровня св-дДНК в плазме крови методом NGS (секвенирование нового поколения) как биомаркера острого отторжения трансплантированного сердца показало положительную прогностическую ценность только на уровне 8,9% и отрицательную прогностическую ценность на уровне 97,1%, что не позволяет исключить необходимость биопсии [31].

В крупном проспективном исследовании, включавшем 171 пациента после трансплантации сердца со средним периодом наблюдения 17,7 мес. (12,1-23,6), оценку уровня св-дДНК проводили методом секвенирования дробовика (shotgun sequencing) с предварительным генотипированием донора и реципиента до трансплантации сердца для определения информативных полиморфизмов для каждой пары донор/реципиент [32]. В результате анализа было установлено, что уровень св-дДНК снижается до 0,13% (0,03-0,21) к 28 дню после операции, а в дальнейшем на фоне острого отторжения аллографта статистически значимо повышаются до 0,38% [ IQR, 0,31-0,83%] по сравнению с контрольным уровнем 0,03% [ IQR, 0,01-0,14%] (р<0,001). Более того, повышение уровня св-дДНК наблюдалось раньше на 0,5 и 3,2 мес. по сравнению с результатами ЭМБ как при остром клеточном, так и при остром гуморальном отторжении. В данном исследовании определение уровня св-дДНК показало отрицательную прогностическую ценность на уровне 99%, что позволяет исключить в 81% необходимость ЭМБ [32].

Некодирующие внеклеточные РНК

Некодирующие РНК (нкРНК) представляют собой многочисленный гетерогенный пул РНК разнообразных по длине, форме и способу образования; характеризуются повсеместным распространением и высокой стабильностью; свободно циркулируют в разнообразных биологических жидкостях в составе белковых комплексов и внеклеточных везикул; участвуют в регуляции сигнальных путей и биологических процессов; обладают аутокринным, паракринным и эндокринным действием. Среди нкРНК описаны малые некодирующие РНК (<200 нуклеотидов), к которым относятся микроРНК (miR), PIWI-взаимодействующие РНК (piwiRNA), малые ядрышковые РНК (snoRNA), фрагменты транспортных РНК (tRF), малые ядерные РНК (snRNA), малые интерферирующие РНК (siRNA), длинные некодирующие РНК (>200 нуклеотидов, IncRNA), и кольцевые ковалентно-замкнутые некодирующие РНК (circRNA) [10].

За последние десятилетия среди нкРНК подавляющее количество исследований было посвящено изучению роли микроРНК, наиболее распространенному классу малых нкРНК, которые способны связываться с 3'UTR матричной РНК и регулировать трансляцию белка, снижая стабильность матричной РНК или активируя ее деградацию. В геноме человека идентифицировано >2300 генов микроРНК с характерными временными и тканеспецифичными паттернами экспрессии, при этом одна микроРНК может регулировать широкий спектр-мишеней [33]. Профили экспрессии микроРНК в клетках, в жидкостях организма и внеклеточных везикулах варьируют в широких диапазонах в норме и при патологии, отражая активные биологические процессы, что позволяет их рассматривать в качестве диагностических биомаркеров и терапевтических мишеней, в т. ч. при ССЗ.

МикроРНК при ССЗ

В патогенезе ССЗ изменение экспрессии микроРНК может влиять на развитие эндотелиальной дисфункции, фиброза, гипертрофии кардиомиоцитов, обуславливать окислительный стресс, воспаление сосудов, за счет регуляции биологических процессов, ассоциированных с ремоделированием сосудов и кардиомиоцитов [34]. При гипертрофии миокарда, ИМ, аритмиях, АГ было обнаружено нарушение профилей miR-1 и miR-133, высоко экспрессирующихся в миоцитах и участвующих в развитии и функционировании кардиомиоцитов [34].

Многочисленные исследования были посвящены поиску микроРНК в качестве ранних биомаркеров ИМ и ОКС [34][35]. Повышение уровня miR-1-3p, miR-19b-3p, miR-208a, miR-223-3p, miR-483-5p и miR-499a-5p в плазме крови может служить перспективными ранними биомаркерами ИМ в течение первых 4 ч после появления симптомов, повышая в сочетании с классическими биомаркерами (тропонин и креатинкиназа МВ) диагностическую чувствительность и специфичность неинвазивных биомаркеров при ИМ [35].

Повышение экспрессии miR-21-5p и miR-221-5p в моноцитах крови пациентов было ассоциировано с риском развития ИБС [36]. Повышенный уровень экспрессии miR-21-5p и miR-146а-5p выявили в плазме крови у пациентов с ОКС, по сравнению со здоровыми добровольцами и пациентами с АГ, однако разницы между ОКС с подъемом сегмента ST и ОКС без подъема сегмента ST обнаружено не было [37]. Низкий уровень miR-21а и высокий уровень miR-221 в плазме крови были характерны для пациентов с различными вариантами ИБС, включая ишемию без коронарной обструкции, в отличие от здоровых добровольцев [38].

В исследовании Wang X, et al. (2020) проводился поиск микроРНК, которые могут быть маркерами для диагностики ИБС, были выявлены четыре микроРНК (miR10a-5p, miR-126-3p, miR-210-3p, miR-423-3p), концентрация которых в сыворотке была значительно снижена при ИБС по сравнению со здоровыми лицами [39]. Yu H, et al. (2021) обнаружили, что у пациентов с ИБС наблюдалась значимо более низкая концентрация miR-101а, чем у пациентов из группы контроля (p<0,001), кроме того, имелась обратная корреляция между уровнем miR-101а и тяжестью течения ИБС, а также липидным профилем [40]. Кросс-секционное исследование установило, что уровень экспрессии miRNA-203 в сыворотке крови отражал уровень экспрессии в миокарде и коррелировал со степенью коронарного атеросклероза у пациентов перед аортокоронарным шунтированием по сравнению с пациентами перед операцией на сердечном клапане [41].

МикроРНК как маркер отторжения трансплантированного сердца

Экспериментальные исследования подтверждают вовлеченность микроРНК в молекулярные процессы, опосредующие отторжение трансплантированного сердца [42][43]. При изучении профиля микроРНК в образцах миокарда мышей и в образцах ЭМБ человека установлено, что острая реакция отторжения аллографта сопровождалась повышением уровня девяти микроРНК (miR-21, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a, miR-146b, miR-155, miR-222, miR-223 и miR-494) и понижением уровня miR-149-5p [42]. В экспериментальной мышиной модели снижение уровня наиболее суперэкпрессированной miR-155 сопровождалось ослаблением внутритрансплантатного воспаления и замедлением отторжения [42]. Также на мышиной модели с трансплантированным сердцем было выявлено, что на фоне инъекций интерлейкина-10 наблюдалось уменьшение выраженности хронического отторжения сердечного трансплантата за счет подавления экспрессии miR-155 в тканях сердца и макрофагах, что указывает на возможность ее использования в качестве потенциальной терапевтической мишени при лечении хронического отторжения сердечного трансплантата [43].

В исследовании, включавшем 113 реципиентов сердца, 7 микроРНК (miR-10a, miR-21, miR-31, miR-92a, miR-142-3p, miR-155 и miR-451) имели значимые изменения в профиле экспрессии у реципиентов с подтвержденным острым отторжением в отличие от реципиентов без отторжения [44]. Более того, изменение уровня miR-10a, miR-31, miR-92a и miR-155 в сыворотке крови полностью коррелировало с их экспрессией в тканях трансплантированного сердца, что позволило четко дифференцировать пациентов с отторжением аллотрансплантата от пациентов без отторжения (miR-10a (AUC=0,975), miR-31 (AUC=0,932), miR-92a (AUC=0,989) и miR-155 (AUC=0,998, р<0,0001)) [44]. В исследовании Великого Д. А. и др. (2020), включавшем 46 реципиентов сердца, уровни экспрессии miR-101 и miR-27 у реципиентов с острым отторжением достоверно отличались от показателей у реципиентов без отторжения (р=0,04 и р=0,03, соответственно) [45].

Комбинированная оценка уровня экспрессии miR-652-3p и miR-144-3p в плазме крови реципиентов сердца показала высокую диагностическую ценность (AUC=0,794 при 1R и AUC=0,892 при ≥2R, p<0,0001) при диагностике острого криза клеточного отторжения аллографта даже при клинически незначимых степенях отторжения и вне зависимости от срока после трансплантации сердца [46].

Результаты многоцентрового проспективного исследования, включавшего комплексный анализ профиля малых нкРНК в плазме крови пациентов с трансплантированным сердцем методом NGS секвенирования и клинических данных, позволили определить 12 микроРНК, специфичных для клеточного отторжения (AUC 0,92 (95% ДИ: 0,86-0,98)), и 17 микроРНК, специфичных для гуморального отторжения (AUC 0,82 (95% ДИ: 0,74-0,90)) [47]. При валидации микроРНК панели для клеточного отторжения в ретроспективном исследовании AUC составил 0,72 (95% ДИ: 0,59-0,82) [47].

Заключение

Результаты исследований показывают, что повышение концентрации св-ДНК в плазме крови может колебаться в широких диапазонах при целом ряде заболеваний сердечно-сосудистой системы. Повышенный уровень св-ДНК может являться надежным признаком ОКС и его тяжести на ранних сроках его развития, а также маркером тяжести течения ИБС. Обнаружена ассоциация между уровнем св-ДНК и функциональным классом ХСН, числом декомпенсаций ХСН, уровнем ФВ ЛЖ. Св-ДНК может являться биомаркером для ранней диагностики отторжения сердечного трансплантата, но сложность методологических подходов оценки данного биомаркера у реципиентов сердца и их высокая стоимость являются препятствием для внедрения в клиническою практику. Дополнительно быстрая потеря стабильности св-ДНК затрудняет использование этого маркера в рутинной лабораторной практике.

В свою очередь, физиологическая внеклеточная циркуляция микроРНК в составе белковых комплексов и внеклеточных везикул обеспечивает целостность микроРНК в течение длительного периода времени, что обуславливает их эффективное использование в качестве диагностических маркеров по сравнению с св-ДНК. Результаты исследований микроРНК свидетельствуют о том, что оценка спектра циркулирующих микроРНК является перспективным подходом для ранней диагностики, мониторинга и прогноза исхода различных патологических состояний при ССЗ. Однако необходимо проведение расширенных кросс-секционных популяционных исследований для оценки прогностической диагностической значимости таргетных микроРНК, разработки и валидации целевых панелей, а также методологических подходов для оценки уровня экспрессии микроРНК в биологических образцах.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда №  24-15-20016, https://rscf.ru/project/24-15-20016/ и за счет гранта Санкт-Петербургского научного фонда (Договор №  24-15-20016 от 24.05.2024).