Молекулы, секретируемые висцеральными адипоцитами у пациентов с коронарным атеросклерозом и инсулинорезистентностью

Под сахарным диабетом (СД) 2 типа подразумевается заболевание, связанное с нарушением обмена углеводов. Термин "инсулинорезистентность" (ИР) был введен в середине ХХв, он заключал в себя каскад метаболических изменений, происходящих не только с углеводами, но и с белками и жирами. Данное понятие стало использоваться для обозначения самого раннего нарушения влияния инсулина на ткани-мишени, в частности, на подкожную жировую клетчатку. Таким образом, ИР начинает формироваться на стадии избыточного веса человека [1][2].

При избыточной массе тела и ожирении, которые преимущественно сопровождают заболевание СД 2 типа, адипоцитами синтезируется большое количество провоспалительных цитокинов: интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухоли-альфа, глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (GIP), глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), глюкагон, лептин, адипонектин, адипсин, липокалин, резистин, моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1, пептид YY (PYY), секретин, PAY-1. Они инициируют хронический воспалительный процесс [3], который оказывает влияние на все этапы формирования атеросклеротической бляшки (АСБ). При этом в ответ на секрецию клетками внеклеточного матрикса ИЛ-6 гепатоцитами начинают синтезироваться и секретироваться в кровь белки острой фазы: фибриноген, С-реактивный белок (СРБ), гаптоглобин, сывороточный амилоид А, альфа-1 ингибитор протеаз, липопротеин(а). В ответ на каскад реакций воспаления происходит инфильтрация сосудистой стенки активированными макрофагами. Местное воспаление усиливается с накоплением липидов, очаг атерогенеза растёт. При этом структура сосудистой стенки становится менее плотной, а на эндотелии формируется фиброзная пластинка, выступающая в просвет сосуда [4]. Дальнейшая миграция макрофагов и Т-лимфоцитов приводит к дестабилизации АСБ, что может повлечь за собой её разрыв и тромбоз [5].

Таким образом, понятия "инсулинорезистентность", "ожирение" и "хроническое воспаление" тесно связаны между собой каскадом патофизиологических реакций. Целью нашего исследования было изучение уровней адипоцитокинов (GIP, GLP-1, глюкагона, инсулина, лептина, адипонектина, адипсина, липокалина, резистина), а также их ассоциаций со стабильными и нестабильными АСБ у пациентов с ИР.

Материал и методы

Дизайн: одномоментное обсервационное исследование. Исследование проводилось в рамках совместных научных исследований НИИТПМ — филиала ИЦГ СО РАН и ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр им. Е. Н. Мешалкина" Министерства здравоохранения Российской Федерации. Образцы и данные были собраны после получения письменного информированного добровольного согласия от всех участников. Исследование было одобрено локальными этическими комитетами обоих учреждений (протокол № 2, от 05.06.2011). Данное исследование финансировалось из средств Гранта РНФ 24-25-00079.

В исследование были включены 109 мужчин в возрасте 38-79 лет (средний возраст 62,28±8,19) со стабильной стенокардией напряжения II-III функционального класса, без острого коронарного синдрома, с верифицированным с помощью коронароангиографии атеросклерозом коронарных артерий со стабильной стенокардией напряжения II-III функционального класса, госпитализированных в клинику ФГБУ НМИЦ им. Е. Н. Мешалкина Минздрава России в период с 2011 по 2022гг на операцию коронарного шунтирования (КШ) (рис. 1).

На этапе предварительного отбора пациентов критериями включения были: мужской пол, эпизоды стабильной стенокардии напряжения или наличие перенесенного инфаркта миокарда (ИМ) в анамнезе, подтвержденных клинической картиной, результатами электрокардиограммы и показателями биохимического анализа крови, диагноз ишемической болезни сердца (ИБС), который верифицирован по результатам коронароангиографии.

Критериями исключения были: женский пол, острый коронарный синдром давностью <6 мес. до поступления (ИМ или нестабильная стенокардия), сопутствующая патология, являющаяся клинически значимой, в острой стадии (дыхательная, печеночная, почечная недостаточность, хронические инфекционно-воспалительные заболевания), а также онкологические процессы в активной стадии.

Во время операции КШ, согласно интраоперационным показаниям, хирурги проводили эндартерэктомию из коронарной(-ых) артерии(-ий). Далее проводились гистологические исследования полученного материала в патоморфологической лаборатории ФГБУ "НМИЦ им. акад. Е. Н. Мешалкина Минздрава России". Материал, полученный с помощью эндартерэктомии, содержал комплекс интима-медиа коронарных артерий и был разделен (продольно и поперечно) на 3-5 фрагментов для возможности проведения и биохимических, и гистологических исследований. Полученные образцы изучались и описывались макроскопически (насколько распространена АСБ, наличие кровоизлияния в строму АСБ, существующая степень сужения просвета сосуда, наличие в структуре АСБ участков обызвествления) и после окраски гематоксилин-эозином изучали микропрепараты по Ван Гизону с помощью бинокулярного микроскопа Axiostar Plus.

Таким образом, после микроскопического исследования фрагментов интима-медиа, определялся тип АСБ: стабильная или нестабильная. Нестабильность АСБ определялась по критериям: инфильтрация Т-лимфоцитами и макрофагами >25 клеток в поле зрения 0,3 мм, фиброзная покрышка имеет толщину <65 мкм и наличие крупного липидного ядра (>40%) [6].

После КШ 6 пациентов покинули исследование по следующим причинам: развились осложнения, не удалось связаться с пациентом, а также был подписан добровольный отказ от участия. У 23 пациентов по результатам гистологического исследования не удалось определить тип АСБ. Итак, в итоговый анализ вошли 80 пациентов. Из исследуемой группы 48 мужчин в коронарных артериях имели стабильные АСБ, 60% (из них 31 человек характеризовались наличием ИР и 17 — отсутствием), а 32 — нестабильные, 40% (из них у 20 наличие ИР и у 12 — отсутствие).

Перед проведением КШ у пациентов производили забор крови для биохимических исследований холестерина, триглицеридов, липопротеинов высокой плотности и липопротеинов низкой плотности, которые проводили в Лаборатории клинических биохимических и гормональных исследований терапевтических заболеваний НИИТПМ — филиал ИЦиГ СО РАН энзиматическим методом на анализаторе Konelab 30i (Thermo, Финляндия). На проточном флуориметре Luminex MAGPIX при помощи мультиплексного анализа и панели Human Metabolic Hormone V3 (MILLIPLEX, Германия) были определены уровни С-пептида, GIP, GLP-1, ИЛ-6, лептина, МСР-1, панкреатического полипептида (РР), PYY, фактор некроза опухоли-альфа, ингибитор активатора плазминогена-1.

При проведении исследования учитывались особенности демографии, анамнез заболевания, наличие артериальной гипертензии, перенесенного ИМ, СД 2 типа, острого нарушения мозгового кровообращения и других неспецифических неинфекционных заболеваний. Пациентам проводилось антропометрическое исследование, которое включало измерение массы тела, роста, окружности бедер и талии (ОТ). Также определялся индекс массы тела с помощью формулы: масса тела (кг)/рост (м²). Измерение ОТ проводилось в положении стоя, между нижним краем грудины и гребнем подвздошной кости (на середине расстояния) по средней подмышечной линии. Наличие абдоминального ожирения диагностировалось при ОТ >94 см [7]. Наличие ИР у пациентов устанавливалось по индексу HOMA-IR из расчета по формуле: HOMA-IR = глюкоза натощак (ммоль/л) × инсулин натощак (мкЕд/мл) / 22,5. HOMA-ir >2,5 [8]. ИР была определена у 63,75% пациентов, 36,25% не имели ИР.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью программного пакета SPSS 13.0. При оценке характера распределения признаков применялся тест Колмогорова-Смирнова. В виде средней арифметической величины (М) и стандартного отклонения (SD) представлены переменный с нормальным распределением. При непараметрическом распределении использовалась Медиана, 25 и 75 квартили. С помощью t-критерия Стьюдента проводилось сравнительное исследование переменных при нормальном распределении. При непараметрическом распределении применялся U-критерий Манна-Уитни (для двух независимых групп) и критерий Крускалла-Уоллиса. Ранговый коэффициент корреляции Спирмена (r_s) был применен в анализе зависимости количественных признаков выборочных данных из совокупностей. В порядковой и номинальных шкалах данных применялись перекрестные таблицы данных и критерий χ² Пирсона с поправкой на вероятность (для расчета ORs). Уровень значимости был принят как р<0,05.

Результаты

Характеристика пациентов. В таблице 1 представлены данные пациентов в зависимости от наличия ИР и типа АСБ — стабильная или нестабильная. Группы мужчин с ИР и без неё были сопоставимы по уровню диастолического артериального давления (АД), систолического АД, возрасту, диагнозу СД 2 типа, статусу курения независимо от типа АСБ. Все пациенты имели установленный диагноз гипертонической болезни и получали антигипертензивную терапию для достижения целевых значений АД.

Состояние дислипидемии у пациентов обеих групп определялось повышением уровня липопротеинов и липидов выше оптимального значения [9]. Пациенты, включенные в исследование, имели очень высокий сердечно-сосудистый риск, поэтому дислипидемия определялась на уровне липопротеинов низкой плотности >55 мг/дл и при уровне триглицеридов >150 мг/дл. Все пациенты, страдающие ИБС, получали терапию статинами в максимально переносимых дозировках (аторвастатин 40-80 мг, розувастатин 20-40 мг) независимо от наличия дислипидемии. В данном исследовании обращает на себя внимание повышение уровня триглицеридов у пациентов с ИР и стабильными АСБ (р=0,010).

Таблица 2 содержит информацию об уровнях адипоцитокинов в зависимости от наличия ИР у пациентов со стабильными и нестабильными АСБ.

При первичном анализе установили, что у пациентов с атеросклерозом и с ИР были выше уровни GIP в 1,4 раза (р=0,005), GLP-1 в 1,7 раза (р=0,032), ИЛ-6 в 3,2 раза (р=0,017), лептина в 2,3 раза (р=0,001) и РР в 1,9 раза (р=0,006).

Адипоцитокины в крови пациентов с ИР и коронарным атеросклерозом. Далее был проведен более детальный анализ с разделением пациентов на подгруппы в зависимости от наличия ИР и типа АСБ (табл. 3).

При сравнении в подгруппах пациентов с разными типами АСБ и наличием ИР были получены следующие данные: у пациентов со стабильными АСБ и ИР лептин был выше в 2 раза (6236,87 [ 3799,86; 8509,36] vs 3112,89 [ 1452,20; 5318,58], р=0,018), а РР выше в 1,7 раза (128,87 [ 66,55; 189;35] vs 75,12 [ 43,07; 137,46], р=0,051) по сравнению с пациентами без ИР. Также было установлено, что уровень лептина у пациентов с нестабильными АСБ и ИР выше в 5,1 раза (8042,07 [ 3499,59; 13673,01] vs 1585,81 [ 790,27; 4970,16], р=0,019), уровень РР выше в 1,7 раза (110,57 [ 51,88; 195,21] vs 63,91 [ 30,20; 98,19], р=0,043), по сравнению с группой пациентов без ИР. Также было установлено, что уровень лептина у пациентов с нестабильными АСБ и ИР выше в 5,1 раз (8042,07 [ 3499,59; 13673,01] vs 1585,81 [ 790,27; 4970,16], р=0,019), уровень РР выше в 1,7 раза (110,57 [ 51,88; 195,21] vs 63,91 [ 30,20; 98,19], р=0,043), по сравнению с группой пациентов без ИР.

У пациентов с ИР и стабильными АСБ РYY был выше в 1,5 раза (50,58 [ 35,26; 65,35] vs 33,45 [ 29,46; 50,58], р=0,040), нежели у пациентов с ИР и нестабильными АСБ, а уровень адипонектина выше в 1,9 раза (26,55 [ 15,40; 41,20] vs 14,20 [ 11,04; 28,58], р=0,015).

Следующий этап заключал в себе проведение логистического регрессионного анализа ассоциации ИР и адипоцитокинов (в частности, лептина, РР, адипонектина и PYY) у пациентов со стабильными и нестабильными АСБ (табл. 4, 5).

Таким образом, логистический регрессионный анализ продемонстрировал, что PP ассоциирован с ИР у пациентов с нестабильными АСБ.

Обсуждение

Известно, что висцеральная жировая ткань, к которой относится эпикардиальная жировая ткань, жировая прослойка вокруг сосудов и т. д. — это эндокринный орган, активно секретирующий различные факторы (в частности, лептин, фактор некроза опухоли, свободные жирные кислоты, интерлейкины 1, 6, усиливающие воспаление эндотелия сосудистой стенки и способствующие развитию и усугублению течения атеросклероза). Адипокины, гормоны жировой ткани, в исследованиях последнего десятилетия играют важную роль в метаболизме липидов, глюкозы, передаче сигнальных цитокинов. Соответственно, их уровни — значимые предвестники кардиометаболических осложнений [10].

Лептин является полипептидным гормоном, участвующим в регуляции многих метаболических, нейроэндокринных и энергетических процессов организма. Лептин регулирует пищевое поведение, через стимуляцию рецепторов гипоталамуса, энергетический обмен и в последние годы показано его влияние практически на все системы организма. Достаточно изучено его воздействие на сердечно-сосудистую систему, а также транскрипцию гена инсулина [11]. Таким образом, у пациентов, страдающих СД, сопровождаемым повышенным уровнем висцеральной жировой ткани, риск осложнений (включая ИМ, стенокардию и сердечную недостаточность) возрастает в 2-4 раза, что обуславливает повышенную смертность среди этих лиц [12]. Доказано атерогенное влияние данного гормона, это обусловлено ускоренным синтезом провоспалительных цитокинов на фоне усиленной агрегации моноцитов и появления пенистых клеток при непосредственном участии лептина [13]. Помимо описанных эффектов, лептин участвует в усиленной агрегации тромбоцитов и увеличении холестерина в клетках-макрофагах, что оказывает отрицательное воздействие на стенки сосудов [14]. Интересное наблюдение сделали ученые Katsiki N, et al.: устойчивость к лептину связана с развитием ИР [15]. В нашем исследовании уровень лептина был выше у пациентов с коронарным атеросклерозом и ИР, по сравнению с пациентами без ИР, однако при проведении логистического регрессионного анализа статистическая значимость по уровню лептина не была достигнута.

Однако существуют адипокины, улучшающие течение сердечно-сосудистых заболеваний путем регуляции углеводного и липидного обменов, а также уменьшения воспаления и снижения окислительного стресса. К таким адипокинам относится адипонектин, который имеет отрицательную корреляцию с маркерами воспаления (СРБ, фактором некроза опухоли альфа, ИЛ-6) и снижает эндотелиальную дисфункцию, что положительно сказывается на течении атеросклероза [16]. Адипонектин через гомологичный домен плекстрина увеличивает синтез и секрецию инсулина путем усиления активности протеинкиназы в тканях, имеющих инсулиновые рецепторы. Также данный адипокин обладает антиатеросклеротическим действием [17], играет ключевую роль в улучшении течения гипертонической болезни [18] и гипертрофии миокарда [19]. Marso SP, et al. было доказано, что низкий уровень циркулирующего адипонектина ассоциирован с утолщением интимы сосудов, нарушением липидного обмена и ухудшением течения атеросклероза [20]. Также была установлена обратная корреляция между уровнем адипонектина у пациентов с ожирением и толщиной интима-медиа сосудов, увеличение которой считается маркером бессимптомного течения атеросклероза [21]. Таким образом, адипонектин снижает окислительный стресс, улучшает эндотелиальную дисфункцию, регулирует липидный обмен, обусловливая улучшение течения атеросклероза. Нами были получены следующие данные: у пациентов с ИР и стабильными АСБ уровень адипонектина был выше, однако при проведении логистического регрессионного анализа нестабильность АСБ у пациентов с ИР не была ассоциирована с уровнем адипонектина.

Благоприятные эффекты на метаболизм также оказывает гормон кишечного происхождения PYY, синтезируемый энтероэндокринными L-клетками. Известно, что уровень данного пептида ниже у людей с ожирением. Его секреция способствует адекватному метаболизму глюкозы, снижает аппетит и увеличивает всасывание электролитов и воды в толстом кишечнике [22]. На сегодняшний день практически не представлено информации о связи РYY с атеросклерозом и нестабильностью АСБ. Однако была установлена корреляция пептида с СРБ (параметром воспалительной реакции), что может говорить о воспалительной регуляции секреции РYY или о результате комплексного воздействия различных факторов хронической воспалительной среды. Также установлено опосредованное влияние РYY на атеросклеротическое поражение через сигналы Y1 и Y2 рецепторов, которые изменяют сократимость миокарда и способствуют вазоконстрикции [23]. В метаболизме углеводов действие PYY направлено на нормализацию секреции инсулина, что является благоприятным фактором в восстановлении островков поджелудочной железы [24]. В нашем исследовании у пациентов с ИР и стабильными АСБ PYY был выше, нежели у пациентов с ИР и нестабильными АСБ, в то же время логистический регрессионный анализ показал, что нестабильность АСБ у пациентов с ИР не ассоциирована с уровнем PYY.

PP представляет собой пептидный гормон, выделяемый поджелудочной железой и регулируемый эфферентными волокнами блуждающего нерва. РР оказывает ингибирующее действие на секрецию инсулина [25], а также сообщается, что он ингибирует высвобождение как глюкагона [26], так и соматостатина [27]. Тощаковый PP связан с висцеральным ожирением и значительно увеличивается у людей с СД 2 типа, но не с нарушением уровня глюкозы натощак или нарушением толерантности к глюкозе, которые не так сильно аcсоциированы с ИБС [28]. Потенциальная роль PP как маркера макрососудистых заболеваний ранее практически не изучалась. Sam AH, et al ¹. изучили данные 1332 взрослых участников с нормальной толерантностью к глюкозе (n=231), предиабетом (n=175) или СД 2 типа (n=926). С поправкой на расчетную скорость клубочковой фильтрации РР достоверно коррелировал с десятилетним Фрамингемским риском (R²=0,39, p<0,0001). У участников мужского пола с СД 2 типа PP был независимым предиктором конечной точки ИБС в логистической регрессии (отношение шансов 5,954 (1,554-22,813, p<0,01)) с поправкой на возраст, индекс массы тела, продолжительность диабета, гликированного гемоглобина, использование инсулина, количество пероральных гипогликемических препаратов, систолическое АД, количество антигипертензивных средств, соотношение липидов. Один только PP имел умеренную прогностическую ценность для конечной точки ИБС (позитивная предсказательная ценность 0,17, негативная предсказательная ценность 0,92, AUC ROC 0,657), однако данные еще не были опубликованы. В нашем исследовании РР был выше как у пациентов со стабильными, так и пациентов с нестабильными АСБ и также был ассоциирован с ИР у пациентов с нестабильными АСБ, что может являться основой для дальнейшего изучения данного маркера в контексте атеросклеротических событий.

Также при наличии ИР у пациентов с атеросклерозом в крови были выше уровни GIP, GLP, ИЛ-6, лептина и РР. Известно, что ИР является фактором риска сердечно-сосудистых событий [28], однако до настоящего времени не ясно, насколько адипоцитокиновый профиль пациентов с ИР ассоциирован именно с нестабильностью АСБ, а не с атеросклерозом в целом, что планируется изучать в дальнейшем.

Преимуществами исследования является гистологический материал для исследования, современные биохимические методы исследования. Ограничением исследования является локальный забор материала для изучения АСБ, набор только лиц мужского пола.

Заключение

Таким образом, при исследовании уровней адипоцитокинов у пациентов с коронарным атеросклерозом было установлено, что среди пациентов с ИР и коронарным атеросклерозом вне зависимости от стабильности АСБ коронарных сосудов были выше уровни GIP, GLP-1, ИЛ-6, лептина и РР. Уровень лептина и РР выше у пациентов и со стабильными, и с нестабильными АСБ и ИР, а уровень РYY и адипонектина выше у пациентов со стабильными АСБ и ИР, по сравнению с пациентами без ИР. Шанс наличия ИР у пациентов с нестабильными АСБ повышен на 1,7% при увеличении РР на 1 пг/мл.

Полученные данные служат основой для более детального исследования уровней РР и лептина у пациентов с атеросклеротической болезнью как маркеров нестабильности АСБ.

Отношения и деятельность. Исследование финансировалось из средств Гранта РНФ 24-25-00079.