Аллельный вариант 6А (rs35068180) промоторной области гена MMP-3 как предиктор развития кардиотоксичности после окончания адъювантной химиотерапии доксорубицином у пациентов со злокачественными новообразованиями молочной железы

На протяжении последних 60 лет доксорубицин и другие препараты антрациклинового ряда используются для лечения злокачественных новообразований различных локализаций. По данным ретроспективных исследований, именно благодаря применению антрациклинов общая пятилетняя выживаемость в ряде случаев достигает 80% [1]. Основываясь на этих результатах, FDA (Food and drug administration, США) одобрило антрациклины как одни из наиболее эффективных и часто применяемых противоопухолевых препаратов. Также они были включены Всемирной организацией здравоохранения в список основных лекарственных средств [2]. К сожалению, использование доксорубицина сопровождается развитием кардиотоксического эффекта. Это связано с реализацией механизма действия веществ и является неотъемлемой частью их природы [3]. В связи с этим поиск и внедрение в рутинную клиническую практику новых предикторов развития кардиотоксичности (КТ) является одной из самых актуальных задач современных медико-биологических исследований в области онкологии [4].

В настоящее время много внимания уделяется молекулярно-генетическим механизмам инициации и развития патологических процессов в организме человека. Несмотря на то, что накопленных данных все еще недостаточно для полного понимания природы КТ, получено немало свидетельств, подтверждающих важность использования ряда индивидуальных генетических и эпигенетических параметров для прогнозирования этого эффекта на фоне химиотерапии [5].

Установлено, что порядка 70 полиморфных вариантов генов связаны с инициацией и развитием антрациклин-опосредованной КТ. Причем около половины из них (45%) расположены в генах, ответственных за транспорт доксорубицина внутрь (семейство SLC) или наружу (семейство ABC) клеточной мембраны, 27% связаны с эскалацией/ингибированием окислительного стресса и свободно-радикальных процессов, 19% с метаболизмом антрациклинов и всего 9% отвечают за репарацию повреждений, наносимых препаратами в клеточном ядре [6]. Важно отметить, что при низких концентрациях препарата в крови роль белков-переносчиков минимальна и проникновение осуществляется преимущественно путем пассивной диффузии, однако в зависимости от индивидуальных особенностей (полиморфного статуса генома) скорость поступления доксорубицина в клетку может изменяться в широких пределах. Особую важность переносчики приобретают при использовании высоких суммарных доз. Например, аллельный вариант А полиморфизма rs8187710 гена ABCC2 связывают со снижением скорости выведения доксорубицина из клетки, что повышает риск развития КТ [7][8].

Несмотря на разнообразие проявлений токсического эффекта доксорубицина, главную роль большинство исследователей отводят свободно-радикальным процессам инициируемым активными формами препарата, например, образующимися при взаимодействии с оксидоредуктазами (ферменты NADH-дегидрогеназы), кодируемые генами NOX2 и NOX4. Образующиеся свободные радикалы повреждают все мембранные структуры клетки, белки цитоплазмы, нарушают работу дыхательной цепи митохондрий, а также после разрушения клеточной мембраны взаимодействуют с белками внеклеточного матрикса, затрудняя регенерацию миокарда [9]. Прогрессирование токсического эффекта радикальных форм доксорубицина напрямую зависит и от активности антиоксидантных систем. В частности, показано, что генотип АА rs2232228 гена HAS3 статистически значимо повышает риск развития КТ у пациентов, получающих доксорубицин. Белок гиалуронан-синтаза в норме обеспечивает синтез гетерополисахарида гиалуронана, который является компонентом внеклеточного матрикса и высвобождается в межклеточное пространство. Наряду с этим гиалуронан обладает антиоксидантными свойствами и принимает непосредственное участие в прерывании свободно-радикальных процессов, связанных с активацией доксорубицина [10][11].

Особое внимание в последние годы уделяется изучению взаимосвязи полиморфизма генов семейства матриксных металлопротеиназ (ММР) с риском развития КТ, поскольку эти белки тесно связаны с эффективностью регенерации и ремоделирования миокарда в ответ на токсическое действие антрациклинов. Среди представителей семейства ММР в этой области принято выделять гены ММР-2, ММР-9 и ММР-3. При этом особого внимания заслуживает полиморфизм гена ММР-3 (rs35068180), расположенный в его промоторной области и представляющий вариацию числа последовательно расположенных дезоксирибонуклеотидов "А". Исследователей привлек факт того, что аллельный вариант 5А (ААААА) связан с более высокой активностью промотора, чем 6А. Это сказывается на уровне матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) и белка ММР-3 в клетках. Собственно, белок ММР-3 отвечает за активацию иных белков семейства: ММР-1, ММР-2 и ММР-9, что играет важную роль в регуляции процессов перестройки внеклеточного матрикса и обеспечении функционирования органов и тканей [12].

Установлено, что наличие аллельного варината 5А связано с коронарными событиями, внутричерепной аневризмой и аневризмой брюшного отдела аорты, окклюзионными заболеваниями периферических артерий. Во всех указанных случаях скорость деградации внеклеточного матрикса повышена. Наряду с этим аллельный варинат 6А статистически значимо более часто встречается при утолщении интима-медиа сонных артерий, прогрессировании ишемической болезни сердца, рестенозе после баллонной ангиопластики, развитии атеросклероза и пр. В этом случае отмечают накопление соединительной ткани и рассматривают процесс как профибротический [13].

На основании имеющихся научных данных в рамках настоящего исследования мы предположили, что: наличие аллельного варианта 6А (rs35068180 гена ММР-3) и опосредованное этим накопление белков внеклеточного матрикса может быть сопряжено с кардиотоксическим эффектом на фоне повреждения миокарда доксорубицином; данный полиморфизм обладает высоким потенциалом в качестве молекулярно-генетического предиктора развития КТ. Наряду с этим интерес может представлять оценка полиморфного статуса rs2232228 гена HAS3 и rs8187710 гена ABCC2, поскольку установлена их роль в процессах развития КТ, но исследования посвящены преимущественно осложнениям КТ спустя ≥12 мес. после окончания адъювантной химиотерапии (ХТ).

Цель: оценить взаимосвязь полиморфных вариантов rs2232228 гена HAS3, rs8187710 гена ABCC2, rs35068180 гена ММР-3 с развитием кардиотоксического эффекта после окончания ХТ у пациентов со злокачественными новообразованиями молочной железы.

Материал и методы

В исследование включено 100 пациентов, проходивших лечение на базе учреждения здравоохранения "Гродненская университетская клиника" (Гродно, Беларусь). Исследование одобрено комитетом по этике Учреждения здравоохранения "Гродненская университетская клиника", протокол № 26 от 09.10.2020г. Данные о пациентах представлены в таблице 1.

Критерии включения разработаны в соответствии с клиническими протоколами диагностики и лечения заболеваний системы кровообращения, утвержденных приказом Министерства здравоохранения Республики Беларусь (МЗ РБ) № 59 от 06.06.2017; клинического протокола "Алгоритмы диагностики и лечения злокачественных новообразований" (приказ № 60 от 06.07.2018, МЗ РБ). В исследование включены пациенты с впервые диагностированным раком молочной железы (РМЖ) старше 18 лет, которые получали ХТ антрациклинами и дали информированное согласие. Критерии исключения: неспособность дать информированное согласие; терапия препаратами не антрациклинового ряда; структурные изменения миокарда; острые реакции на ХТ. Критерии включения: первичный верифицированный резектабельный РМЖ I-III стадии (Т0-4N0-3M0); подтипы люминальный А, люминальный В, HER2-отрицательный; тройной негативный рак. В соответствии со стандартами лечения пациентов с РМЖ антрациклины назначают только в виде комбинированной терапии, и только эта комбинация с циклофосфомидом (схема AC) была выбрана для ограничения действия других кардиотоксических химиотерапевтических агентов. Поэтому в настоящем исследовании оценивали КТ у пациентов, получавших антрациклин и циклофосфамид по схеме 4 и 6 курсов (АСх4 и АСх6): антрациклин в дозе 60 мг/м² и циклофосфамид в дозе 600 мг/м². Часть пациентов после окончания ХТ по схеме АСх4, получали вторую часть адьювантной программы ХТ, включая таксаны.

Ультразвуковое исследование проводили на аппарате GE Vivid E95 с измерением фракции выброса (ФВ) левого желудочка (ЛЖ) по методу Симпсона и оценку динамики глобальной продольной деформации миокарда (global longitudinal strain, GLS) ЛЖ методом speckle tracking эхокардиографии (ЭхоКГ). КТ оценивали в течение 7-21 дня после окончания всех курсов ХТ. Диапазон обусловлен логистическими ограничениями в силу проведения лечения амбулаторно. Наличие кардиотоксического эффекта оценивали на основании рекомендаций Европейского общества кардиологов 2021г по диагностике и лечению хронической сердечной недостаточности; опубликованного консолидированного экспертного мнения специалистов Американского общества по эхокардиографии и Европейской ассоциации по кардиоваскулярной визуализации, посвященного диагностике антрациклиновой КТ 2022г, в которых определены критерии кардиотоксического действия, принятые как снижение ФВ ЛЖ более 10% от исходного значения и менее нижней границы нормы (<50%), снижение GLS >15% относительно исходных значений. Также на основании рекомендаций Европейского общества онкологов (снижение ФВ ЛЖ >10% от исходного значения и менее нижней границы нормы (<50%), снижение GLS >12% относительно исходных значений). В соответствии с этим пациенты разделены на подгруппы с КТ (КТ+) и без КТ (КТ-).

Взятие образцов крови пациентов осуществлялось в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт (этилендиаминтетрауксусная кислота). Выделение общей фракции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) проводили согласно инструкции производителя набора реагентов "ДНК-Экстран-1" (Закрытое акционерное общество "Синтол", Российская Федерация). Каждый образец ДНК генотипировали методом аллельной дискриминации однонуклеотидных замен с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, а также все манипуляции с нуклеотидными последовательностями проводили с использованием Ugene v.47.0 (Unipro, Российская Федерация) и встроенного алгоритма Primer3. Последовательности олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Генотипирование проводили с использованием реагентов производства Общества с дополнительной ответственностью "Праймтех", Беларусь, с соблюдением следующих требований: конечный объем реакционной смеси (в пробирке), включающей все компоненты для проведения ПЦР-РВ, а также ДНК-матрицу — 25 мкл; концентрация ионов магния в реакционной смеси 2 ммоль/л; концентрация дНТФ (дезонуклеотидтрифосфат) в реакционной смеси 0,2 ммоль/л каждого (дА, дТ, дЦ и дГ); количество термостабильной Taq ДНК-полимеразы 1,25 единицы активности (ед.); количество ДНК-матрицы 50-500 нг/реакцию; количество каждого олигонуклеотида, включая зонды для ПЦР-РВ 10 пмоль/реакцию (концентрация 400 нмоль/л). Режим термоциклирования: первичная денатурация +95º С — 2 мин; циклирование (50 циклов): денатурация +95º С — 5 сек, отжиг 58º С 10 сек, элонгация +72º С — 20 сек. Детекция по каналам FAM (карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель (500/520 нм)) и HEX (гексахлорофлуоресцеин, флуоресцентный краситель (540/560 нм)) в конце каждого цикла.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы SPSS Statistics 27 (IBM, США). Полученные данные интерпретировали как достоверные, различия между показателями считались значимыми при величине безошибочного прогноза, равной или больше 95% (р<0,05) [14]. Различия между исследуемыми показателями оценивали с помощью критерия углового преобразования Фишера. Факторный анализ проводили с использованием метода главных компонент. Метод вращения — Варимакс. Критерий Кайзера-Мейера-Олкина (КМО) — >0,500.

Исследование выполнено в рамках задания программы — 3.57 Государственной программы научных исследований "Трансляционная медицина", подпрограммы 4.3 "Инновационные технологии клинической медицины" 2023-2025гг (взятие образцов биологического материала, выделение общей фракции ДНК, молекулярно-генетический анализ статуса полиморфного варианта гена ММР-3).

Результаты

В таблице 3 приведены данные о динамике показателей ФВ ЛЖ и GLS в исследуемой выборке (n=100). В подгруппе КТ+ зарегистрировано статистически значимое снижение относительного изменения GLS в %.

Распределение частот встречаемости генотипов и аллельных вариантов генов-мишеней для подгрупп КТ+ и КТ- представлено в таблице 4.

Наличие или отсутствие статистически значимых различий соответствовало результатам факторного анализа, проведенного для молекулярно-генетических, лабораторных (биохимические) и ЭхоКГ показателей. Генотип 6А/6А rs35068180 гена ММР-3 был сгруппирован — КМО =0,502 (р<0,001) в один фактор с показателем КТ (здесь и далее относительное снижение GLS в % согласно рекомендациям, 12% и 15%). Та же тенденция выявлена и для аллельного варианта 6А при значениях критерия КМО =0,492. Для генотипа АА rs2232228 гена HAS3 — КМО =0,503 (р<0,001) при этом аллельный вариант А не был сгруппирован с показателем КТ. Как генотип АА, так и аллельный вариант А rs8187710 гена ABCC2 были сгруппированы в один фактор с показателем КТ, однако значение КМО =0,493 было ниже порогового.

Обсуждение

Известно, что механизм действия доксорубицина реализуется в нескольких направлениях. Одним из наиболее важных является инициация свободнорадикальных процессов, затрагивающих как клеточные мембраны, так и мембранные органоиды, такие как митохондрии, эндоплазматический ретикулум, ядро. Поскольку уровень активности антиоксидантных систем в миокарде не является высоким, миокард страдает от чрезмерно эффективного воздействия доксорубицина. С этим связан стремительный рост числа кардиомиоцитов, переходящих в состояние апоптоза и некроза. На фоне этого изменяется фенотип тканевых макрофагов и реализуется эскалация воспаления. В ряде случаев эти процессы стимулируют выработку белка ММР-3, который, в свою очередь, активирует транскрипцию ММР-2, ММР-9 и других металлопротеиназ [15].

Снижение активности систем выведения доксорубицина из клетки (ABCC1, ABCC2) и производства антиоксидантов (HAS3 и др.) может в значительной степени усугубить кардиотоксический эффект, а также способствовать развитию таких его осложнений, как дилатационная кардиомиопатия и позднее сердечная недостаточность — одна из главных причин смерти онкологических пациентов не от основного заболевания [16]. Важно отметить, что в рамках нашего исследования действительно патогенный аллель А и генотип АА rs2232228 гена HAS3 статистически значимо чаще встречались в подгруппе КТ+, что можно объяснить более низким уровнем соответствующего фермента — гиалуронан-синтазы и как следствие снижение уровня вырабатываемого ей гиалуронана в цитоплазме и внеклеточном пространстве. Это, в свою очередь, снижает защитный потенциал антиоксидантных систем. В то же время ни у одного пациента в подгруппе КТ+ не удалось выявить наличие патогенного аллельного варианта А и генотипа АА белка rs8187710 гена ABCC2. С одной стороны, для Европейской популяции характерна низкая встречаемость этого аллельного варианта (5-10%, чаще 6%). Однако в ряде исследований показана его роль как предиктора развития КТ при использовании сравнительно высоких суммарных доз антрациклинов [17]. В нашем случае суммарная доза в 240 или 360 мг/м² считается низкой, что может обуславливать отсутствие взаимосвязи низкой активности ABCC2 с развитием КТ.

Взаимосвязь между уровнем мРНК гена ММP-3 и статусом полимофрного варианта rs35068180 последовательности его промоторной области обоснована и подтверждена в ряде исследований. Наличие аллельного варианта 5А снижает сродство ингибиторов транскрипции к промотору, что позволяет более эффективно нарабатывать мРНК. При этом важную роль играет провоспалительный профиль микроокружения, выступающий в качестве индуктора экспрессии MMP-3 в клетках. Аналогично этому происходит индукция транскрипции гена MMP-3 и в случае наличия аллельного варианта 6А, за исключением того, что сродство ингибиторов к промоторной области в несколько раз сильнее. Это затрудняет организацию транскрипционного комплекса и уменьшает конечное количество синтезируемых копий мРНК [18].

В ходе токсического повреждения печени, легких и сердечной мышцы, создаются условия, опосредующие индукцию ММР-3 с целью запуска ряда компенсаторных механизмов. Установлено, что генотип 5А/5А при этом статистически значимо чаще встречается в случае систолической и диастолической дисфункции ЛЖ, заболеваниях коронарных артерий, инфаркте миокарда. Повышение уровня мРНК ММР-3 у носителей аллельного варианта 5А приводит к увеличению скорости распада белков внеклеточного матрикса не только за счет активности соответствующего белка (ММР-3), но и за счет высокой интенсивности активации транскрипции других металлопротеиназ. Это выражается в нарушении соотношения белков внеклеточного матрикса, общем снижении их количества, изменении структуры и функции миокарда. Исследования показывают, что генотип 6А/6А наоборот может способствовать снижению скорости активации белков семейства металлопротеиназ, зависимых от ММР-3, и как следствие накоплению белков внеклеточного матрикса, что также нарушает структуру и функцию миокарда, стимулируя развития фиброза [19].

В 2007г группа исследователей из Китая — Tang L-J, et al. показала, что генотип 5А/6А rs35068180 гена ММР-3 статистически значимо встречается в группе пациентов с установленным диагнозом идиопатическая дилатационная кардиомиопатия. Они определили такой генотип как фактор увеличивающий риск развития дилатационной кардиомиопатии в течение жизни — показатель отношения рисков составил 2,718 (95% доверительный интервал: 1,454-5,081) [20]. Позже группа российских авторов — Копьева К. В. и др. (2023) установили, что генотип 5А/5А изучаемого полиморфизма гена ММР-3 статистически значимо более часто встречается у онкологических пациентов с установленным диагнозом РМЖ на фоне развития признаков КТ опосредованной терапией препаратами антрациклинового ряда по сравнению с пациентами без КТ. Данный полиморфизм рассматривался авторами как предиктор развития КТ спустя 12 мес. после окончания ХТ антрациклинами [21]. В работе Черняк С. В. и др. (2023) много внимания уделяется вопросам профилактики ранней КТ при лечении РМЖ препаратами антрациклинового ряда [22]. В связи с этим важным аспектом профилактики развития кардиотоксического эффекта препаратов является поиск молекулярно-генетических предикторов, способствующих выявлению пациентов, попадающих в зону повышенного риска.

Ограничения исследования: а) не учитывается факт того, что пациенты, получившие суммарную дозу доксорубицина 240 мг/м², прошли ЭхоКГ после окончания адъювантной терапии доксорубицином раньше, чем пациенты, поучившие суммарную дозу 360 мг/м², различается временной интервал между ЭхоКГ до и после терапии; б) сравнительно небольшой объем выборки, количество пациентов в подгруппе КТ+ <20; в) отсутствие данных о статусе метилирования промоторной области гена ММР-3.

Перспективы дальнейших исследований: а) расширение перечня полиморфных вариантов генов, вовлекаемых в процессы ремоделирования миокарда и формирования ниши для дифференцировки фибробластов; б) увеличение сроков наблюдения до 12, 24, 36 мес. после окончания ХТ; в) увеличение объема выборки; г) наряду с установлением полиморфного статуса генов-мишеней, получение данных о статусе метилирования их промоторной области.

Заключение

В рамках нашего исследования установлено, что генотип 6А/6А, аллельный вариант 6А rs35068180 гена ММР-3, генотип АА и аллельный вариант А rs2232228 гена HAS3 могут рассматриваться как предикторы развития ранней КТ на этапе после окончания ХТ у пациентов с диагнозом РМЖ, получающих лечение доксорубицином.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено в рамках задания программы — 3.57 Государственной программы научных исследований "Трансляционная медицина", подпрограммы 4.3 "Инновационные технологии клинической медицины" 2023-2025гг (взятие образцов биологического материала, выделение общей фракции ДНК, молекулярно-генетический анализ статуса полиморфного варианта гена ММР-3).