Особенности экспрессии ферментов метаболизма церамидов в жировых депо различной локализации при сердечно-сосудистых заболеваниях

Несмотря на проводимые профилактику и лечение, смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) остается высокой. Поэтому поиск новых диагностических подходов к оценке риска развития и прогрессирования ССЗ является актуальной задачей [1]. Появляется все больше данных о том, что церамиды играют важную роль в развитии атерогенных и неатерогенных заболеваний сердца [2].

Церамиды — это биоактивные липиды, которые не только являются структурными компонентами клеточных мембран, но и участвуют в передаче сигналов и в метаболизме, в реакциях на стресс, апоптозе, регулируют пролиферацию и гибель клеток, в т.ч. адипоцитов [3]. Считается, что накопление церамидов ассоциировано с неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями [4]. Ранее нами продемонстрировано, что коронарогенная патология жировой ткани (ЖТ) сердца характеризуется активацией синтеза церамидов de novo, преимущественно в эпикардиальной локализации, что может приводить к аккумуляции церамидов, потенцируя ряд патологических процессов, ассоциированных с атеросклерозом [5].

Известно, что церамиды в ЖТ могут образовываться не только de novo, но и из сфингомиелина (SM) [6]. Этот путь реализуется при помощи сфингомиелиназ (SMase) и является быстрым временным механизмом, за счет которого уровень церамидов в адипоцитах может резко повышаться в несколько раз [3][7]. Провоспалительные цитокины, высокий уровень которых ассоциирован с атеросклерозом (фактор некроза опухоли-α, интерлейкин-1β и интерферон-γ), стимулируют активность SMase, повышая концентрацию церамидов в клетках, что, вероятно, может быть реализовано и в адипоцитах ЖТ сердца и коронарных артерий. Ранее нами была показана высокая экспрессия провоспалительных адипоцитокинов в эпикардиальной ЖТ (ЭЖТ) [8]. Наряду с активацией воспаления в ЭЖТ нами было обнаружено и увеличение размеров жирового депо этой локализации у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), что на фоне дислипидемии может приводить к локальной гипоксии и активации факторов, индуцируемых гипоксией, таких как, например, HIFs. В свою очередь, HIF-1α в адипоцитах повышает экспрессию SMase, активируя тем самым синтез церамидов из SM.

Содержание церамидов в адипоцитах зависит от соотношения скорости их образования и утилизации, что особенно важно для ЭЖТ и периваскулярной ЖТ (ПВЖТ), локализованных в непосредственной близости от очага поражения при ССЗ [9]. Показано, что ингибирование синтеза либо ускорение деградации церамидов приводит к снижению их уровня в клетках и тканях и улучшает течение атеросклероза [10]. Деградация церамидов на сфингозин и свободные жирные кислоты в аппарате Гольджи опосредуется ферментом церамидазой. Идентифицировано 5 различных церамидаз в соответствии с оптимальным рН для их каталитической активности: кислая (ASAH1, pH=4,5), нейтральная (ASAH2, pH=7,5), щелочная церамидаза 1 (ACER1, pH=8,5), щелочная церамидаза 2 (ACER2, pH=9,0) и щелочная церамидаза 3 (ACER3, pH=9,5). В сердце экспрессируется кислая церамидаза ASAH1, сверхэкспрессия которой снижает гибель кардиомиоцитов и обеспечивает кардиопротекцию [11].

Церамиды являются субстратом для фермента сфингомиелинсинтазы (SMS), имеющей несколько изоформ. SMS1 отвечает за синтез SМ в аппарате Гольджи (SGMS1), SMS2 локализован в плазматической мембране (SGMS2). В результате этой реакции образуется SM, содержание которого в стенке аорты и плазме ассоциировано с атеросклерозом. Стратегия снижения/нормализации уровня церамидов при инфаркте миокарда (ИМ), артериальной гипертензии и атеросклерозе привлекает все больше внимания исследователей [12].

В настоящее время данных об особенностях экспрессии генов ферментов метаболизма в ЖТ недостаточно, практически все они ограничены результатами экспериментальных работ на моделях грызунов [13]. В то же время изменение их активности в ЖТ сердечной локализации может вызывать избыточный синтез и накопление церамидов не только в ЖТ, но и в кардиомиоцитах. Аккумуляция церамидов способна индуцировать целый ряд патологических процессов, ассоциированных с атерогенезом. Поэтому целью исследования явилось выявление особенностей экспрессии генов ферментов сфингомиелиназного пути биосинтеза церамидов и ферментов деградации церамидов в жировых депо различной локализации у пациентов с ССЗ.

Материал и методы

В исследование включено 38 пациентов, подписавших добровольное информированное согласие на участие, среди которых было 20 пациентов с ИБС в возрасте до 75 лет (основная группа). Группу сравнения составили 18 пациентов с некоронарогенными патологиями сердца — дегенеративные неревматические приобретенные пороки сердца (ППС) (аортальный стеноз/недостаточность) и показаниями для проведения открытой операции на клапанах сердца, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Все пациенты имели показания для проведения открытого вмешательства на сердце — прямой реваскуляризации миокарда методом коронарного шунтирования или операции на клапанах сердца. В исследование не включали пациентов старше 75 лет, с наличием клинически значимой сопутствующей патологии (сахарный диабет 1 и 2 типа, ИМ, анемия, почечная и печеночная недостаточность, онкологические и инфекционно-воспалительные заболевания в период обострения, аутоиммунные заболевания). На госпитальном этапе все пациенты получали стандартную медикаментозную терапию в соответствии с рекомендациями Минздрава России (2020) и Европейского общества кардиологов (2020). Подробная клинико-анамнестическая характеристика и методы исследования представлены ранее [5]. Во время оперативного вмешательства (коронарное шунтирование или коррекции пороков сердца) были получены образцы ЖТ подкожной (ПЖТ), ЭЖТ и ПВЖТ локализации (3-5 г), которые подвергались криогенной заморозке жидким азотом с последующим хранением при температуре -150ºС. Источником ПЖТ служила подкожная клетчатка нижнего угла средостенной раны, ЭЖТ — правые отделы сердца (правое предсердие и правый желудочек), ПВЖТ — область правой коронарной артерии.

Оценка генной экспрессии. Для измерения экспрессии генов ферментов синтеза и деградации церамидов использовался метод количественной полимеразной цепной реакции с праймерами, синтезированными ЗАО "Евроген" (г. Москва, Россия), на амплификаторе ViiA 7 (Applied Biosystems, США). Структура праймеров представлена в таблице 1.

Анализ ферментов метаболизма церамидов в адипоцитах ЖТ различной локализации у пациентов с ССЗ методом вестерн-блотт. Анализ уровня ферментов синтеза и деградации церамидов в адипоцитах ЖТ пациентов исследуемых групп был проведен методом иммуноблоттинга (вестерн-блоттинг) с использованием соответствующих наборов (ARY005B, R&D Systems; ab193655, Abcam) в соответствии с протоколами производителя. Хемилюминесцентная детекция проводилась посредством цифрового сканера блоттов C-DiGit (LI-COR Biosciences) в высокочувствительном режиме (12-мин сканирование). Для иммуноблоттинга использовались антитела кролика фирмы Cusabio (Китай) к ферментам синтеза и деградации церамидов, антитела козы к бета-тубулину (контроль загрузки, ab21057, 1:1000, Abcam) и конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные антитела козы против кролика (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074, Cell Signaling Technology). Инкубация с антителами выполнялась c применением набора iBind Flex (SLF2020, Invitrogen), карточек iBind Flex (SLF2010, Invitrogen) и прибора iBind Flex Western Device (SLF2000, Invitrogen) в течение 3 ч в соответствии с протоколами производителя. Хемилюминесцентная детекция проводилась с использованием субстрата SuperSignal West Pico PLUS (34580, Thermo Scientific) и цифрового сканера блотов C-DiGit (LI-COR Biosciences) в высокочувствительном режиме (12-мин сканирование). Изображение сканировали и анализировали при помощи программ обработки изображений Empiria Studio и Image Studio.

Денситометрию выполняли с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health) по стандартному алгоритму (последовательный выбор и графическое представление полос в виде пиков с измерением их площади и последующей поправкой на контроль загрузки (β-tubulin) и группу сравнения (пациенты с ППС).

Статистический анализ. Статистический анализ полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). Данные представлены в виде медианы, 25-го и 75-го процентилей. Для анализа межгрупповых различий использовали непараметрические критерии. Сравнение двух независимых групп проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни. Категориальные переменные, выраженные в процентах, сравнивали с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера. Значения р<0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Экспрессия генов ферментов сфингомиелиназного пути синтеза церамидов. Получено, что в ЖТ сердечной локализации в большей степени экспрессировалась кислая SMase (aSMase) SMPD1, чем нейтральная SMPD3. При ИБС уровень мРНК SMPD1 был максимальным в подкожных (p=0,011) и эпикардиальных адипоцитах (p=0,002) (рис. 1). При пороках сердца экспрессия SMPD1 в подкожных адипоцитах была выше, чем в периваскулярных (p=0,026) (рис. 1). Экспрессия SMPD3 не различалась в зависимости от нозологии и локализации жирового депо (рис. 2).

Учитывая, что экспрессия гена SMPD1 в ЭЖТ при ИБС была более выражена, чем у пациентов с пороками сердца, можно предположить, что в ЖТ данной локализации при коронарогенной патологии активируется гидролиз SM, а церамиды, синтезируемые aSMase в ЖТ, могут участвовать в атерогенезе.

Экспрессия генов ферментов деградации церамидов. Недостаток ферментов катаболизма также может приводить к накоплению церамидов в клетке, поэтому была оценена экспрессия генов ферментов деградации церамидов. Показано, что уровень мРНК ASAH1 в ЭЖТ пациентов с ИБС был максимальным относительно ЖТ других локализаций (р=0,026, р=0,034) (рис. 3). В группе ППС наблюдалась высокая экспрессия ASAH1 во всех типах ЖТ. При этом у лиц с пороками сердца уровни мРНК ASAH1 в ПЖТ (р=0,0003), ЭЖТ (р=0,037) и ПВЖТ (р=0,002) значительно превышали аналогичные показатели пациентов с ИБС (рис. 3).

Церамиды являются субстратом для образования более сложного сфинголипида — SM под действием фермента SMS. У SMS существует несколько изоформ, в настоящем исследовании определяли экспрессию генов SMS1 и -2 (SGMS1 и SGMS2).

При ИБС экспрессия SGMS1 в ЭЖТ была выше, чем в ПЖТ (р=0,0013) и ПВЖТ (р=0,0011), в отличие от группы ППС (рис. 4). Генная экспрессия SGMS1 в ЭЖТ пациентов с ИБС была выше, чем у лиц с пороками сердца (р=0,0011). Уровень мРНК SGMS2 значимо превышал SGMS1 у пациентов обеих групп и был максимальным в адипоцитах ПЖТ и ПВЖТ по сравнению с ЭЖТ (р=0,0011, р=0,0011) в группе ИБС и в ПВЖТ (р=0,0011, р=0,0011) в группе ППС (рис. 5). При этом при наличии коронарогенной патологии отмечалась высокая экспрессия SGMS2 в подкожных (р=0,013) и эпикардиальных (р=0,0013) адипоцитах.

Определение уровня белков, кодируемых генами ферментов сфингомиелиназного пути синтеза церамидов и их деградации в ЖТ различной локализации (ПЖТ, ЭЖТ, ПВЖТ) у пациентов с ССЗ. Для получения информации об особенностях белковой экспрессии ферментов синтеза церамидов из SM были оценены уровни aSMase1 и nSMase3 с использованием иммуноблоттинга (вестерн-блоттинг). Обнаружено, что уровни изучаемых белков статистически значимо не различались между группами. Кроме того, были изучены ферменты утилизации церамидов. У пациентов с ИБС экспрессия фермента ASAH1 значительно ниже в сравнении с пороками сердца в подкожных и эпикардиальных адипоцитах (р<0,05). Пациенты с ИБС характеризовались более высоким уровнем активности SMS1 в ЭЖТ, чем лица с пороками сердца. Экспрессия SMS2 также была значительно выше при ИБС в адипоцитах ПЖТ (р<0,05). Анализ уровня ферментов метаболизма церамидов в адипоцитах ЖТ пациентов с ССЗ показал сходную картину, полученную при изучении экспрессии генов с использованием количественной полимеразной цепной реакции (рис. 6).

Таким образом, коронарогенная патология ЖТ сердца (преимущественно эпикардиальной локализации) характеризуется не только повышенной экспрессией ферментов синтеза церамидов из SM, но и активацией утилизации церамидов по пути образования сфингозина, что, в свою очередь, может способствовать еще большей аккумуляции церамидов и SM, который ассоциирован с атеросклеротическими процессами.

Обсуждение

Ранее проведенные клинические и экспериментальные исследования продемонстрировали роль церамидов в развитии атеросклероза [14][15]. Недавно была показана важная роль SMase в физиологии и патофизиологии сердечно-сосудистой системы [3]. Их активация в различных типах клеток сердечно-сосудистой системы, а именно в кардиомиоцитах, эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов приводит к высвобождению церамидов и других биоактивных липидов (сфингозин и сфингозин-1-фосфат), обладающих специфической сигнальной способностью. ЭЖТ и ПВЖТ, расположенные в непосредственной близости к очагу поражения, являются активными источниками церамидов и представляет собой специфический липидомный признак ИБС, демонстрируя повышенное содержание атерогенных церамидов [16].

Сфингомиелиназный путь образования церамидов протекает преимущественно в плазматической мембране, но ферменты идентифицированы в лизосомах и эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) [17]. Сфингомиелиназный путь образования церамидов включает в себя один субстрат — SM и единственный фермент — SMase, гидролизующий фосфодиэфирную связь SM с образованием церамида и фосфохолина [7]. Существует три основных типа SMase в соответствии с их оптимальным pH: aSMase (лизосомальная и плазматическая), нейтральная SMase ЭПР/ядра и плазматической мембраны (nSMase) и щелочная SMase (alk-SMase), присутствующая в желудочно-кишечном тракте и желчи, поэтому она в данном исследовании не оценивалась. SMase локализованы в адипоцитах, макрофагах, но экспрессия их генов (SMPD1 и SMPD3) наиболее выражена в кровеносных сосудах и внеклеточных областях, окружающих сосуды в ЖТ [3]. Показано, что ингибирование синтеза церамидов у мышей предотвращает атеросклероз и развитие сердечной недостаточности [18].

В проведенном исследовании уровень мРНК aSMase (SMPD1) в эпикардиальных адипоцитах пациентов с ИБС был выше по сравнению с адипоцитами ПЖТ, ПВЖТ и аналогичными показателями лиц с пороками сердца. В связи с чем можно предположить, что в ЖТ эпикардиальной локализации активируется сфингомиелиназный путь биосинтеза церамидов, которые могут участвовать в атерогенезе. Аналогичные данные о повышенной экспрессии SMase SMPD1 в висцеральной ЖТ относительно ПЖТ у пациентов с ожирением показали Kolak M, et al. (2012) [19].

Активаторами SMase в эндотелиальных клетках сосудов, пораженных атеросклерозом, являются ишемический/реперфузионный стресс и провоспалительные цитокины, высокий уровень которых ассоциирован с атеросклерозом (фактор некроза опухоли-α, интерлейкин-1β и интерферон-γ). В результате повышается уровень церамидов в клетках, что, вероятно, может быть реализовано и в адипоцитах ЖТ сердца и коронарных артерий [3]. Увеличение уровня мРНК провоспалительных адипоцитокинов в ЭЖТ было продемонстрировано в ранее проведенных исследованиях [8]. Усиленный биосинтез церамидов под действием aSMase может быть опосредован Toll-like рецепторами (TLR) 4. Так, активация TLR4 экзогенным С2 церамидом способствует гидролизу SM с образованием церамидов [20]. Помимо инициации воспаления нами было выявлено увеличение размеров ЭЖТ у пациентов с ИБС, что при дислипидемии может вызывать локальную гипоксию и активацию факторов, индуцируемых гипоксией, таких как HIFs [8]. Показано, что HIF-1α в адипоцитах повышает экспрессию SMase, стимулируя образование церамидов из SM, ассоциированных с развитием и прогрессированием атеросклероза [21].

Активность aSMase, который является геном "домашнего хозяйства" в лизосомах, обнаруживается во всех тканях сердца крыс, мышей и людей. Экспериментально показано, что применение ингибитора аSMase перед ишемическим повреждением снижает индуцированную ишемией гибель клеток [22]. У мышей, крыс и кроликов продемонстрировано увеличение уровня церамидов при ишемии/реперфузии, aSMase и nSMase в зоне ИМ, а у пациентов с острым коронарным синдромом выявлена связь с дестабилизацией атеросклеротических бляшек [23].

Для подержания клеточного гомеостаза и функциональной активности клетки, в т.ч. адипоцита, необходим баланс ферментов синтеза и утилизации церамидов. Дефицит ферментов катаболизма может приводить к накоплению церамидов в клетке. Усиление деградации церамидов обладает благоприятными кардиометаболическими эффектами, что важно для профилактики и лечения ССЗ [4][24]. Поэтому нами было проведено изучение уровня ферментов катаболизма церамидов.

Согласно полученным результатам, при ИБС максимальный уровень мРНК ASAH1 наблюдался в ЭЖТ, в то время как при ППС экспрессия ASAH1 была значимо выше в ЭЖТ и ПВЖТ. В лизосомах активность ASAH1 зависит от небольшого белка, сапозина D [25]. Дефицит сапозина D вызывает накопление церамидов в тканях, т.е. сапозин D является положительным модулятором ASAH1. Учитывая, что экспрессия церамидазы в адипоцитах ЖТ сердца и сосудов пациентов с пороками сердца значительно превышала таковую лиц с ИБС, можно высказать предположение, что при некоронарогенной патологии сердца наблюдается не только активация ферментов синтеза церамидов, но и ферментов утилизации, например, лизосомальной церамидазы. Лизосомальная церамидаза деацилирует церамиды, образующиеся при деградации сфинголипидов плазматической мембраны. ASAH1 гидролизует в основном ненасыщенные коротко- и длинноцепочечные церамиды [26]. Несмотря на сниженную по сравнению с ППС экспрессию ASAH1, этот путь катаболизма церамидов реализуется и в ЭЖТ пациентов с ИБС. Таким образом, фермент наилучшим образом работает в ЖТ пациентов с пороками сердца. Высокая экспрессия фермента кислой церамидазы в ЭЖТ лиц с коронарогенной патологией может свидетельствовать о том, что церамиды, накапливаемые в результате сфингомиелиназного пути в ЭЖТ, утилизируются за счет активности фермента кислой церамидазы. Образующийся сфингозин может фосфорилироваться сфингозинкиназой в сфингозин-1-фосфат, обладающий свойствами, противоположными церамидам. В то же время сфингозин является субстратом для CERS и может повторно включаться в биосинтез церамидов de novo [27].

Церамиды являются субстратом для образования SM, который обнаруживается в атеросклеротических бляшках людей [2]. SМ является основным сфинголипидом в атерогенных апоВ-содержащих липопротеинах, таких как липопротеиды очень низкой плотности, липопротеиды низкой плотности (ЛНП) и хиломикроны. При этом ЛНП бляшек содержат намного больше SM, чем ЛНП плазмы [28]. Показано, что содержание SM в стенке аорты и в плазме ассоциировано с атеросклерозом, поскольку SM накапливается в атеромах людей. Плазменный уровень SM считается независимым фактором риска ИБС и ассоциирован с риском развития ИМ [29]. Имеются сведения, что содержание SM в атеросклеротических бляшках гораздо больше, чем ЛНП плазмы. Сочетание дефицита SMS1+2 с нокаутом ApoE или рецептора ЛНП уменьшает атеросклеротические проявления [28].

Синтез SM в клетках протекает при участии фермента SMS, имеющей несколько изоформ: SMS1 локализована в аппарате Гольджи, SMS2 — преимущественно в плазматической мембране. Церамиды, образуемые в ЭПР, посредством везикулярного и невезикулярного транспорта переносятся в аппарат Гольджи, где метаболизируются в сложные сфинголипиды, в т.ч. в SM [26].

Согласно полученным нами данным, высокая экспрессия SMS1 в ЭЖТ пациентов с ИБС сочеталась с максимальной экспрессией SMS2 в ПЖТ и ПВЖТ, превышающими аналогичные показатели лиц с ППС. Вероятно, при коронарогенной патологии активированы пути синтеза SM не только внутри адипоцита, но и в большей степени в плазматической мембране адипоцита.

Ограничения исследования. Исследование имеет определенные ограничения. Во-первых, это одноцентровое исследование, во-вторых, размер выборки небольшой. В-третьих, необходимо липидомное профилирование жировых депо сердца и коронарных сосудов больных с ССЗ, что является частью плана дальнейшей работы.

Заключение

Таким образом, при коронарогенной патологии в ЖТ сердца (преимущественно эпикардиальной локализации) отмечается усиление экспрессии ферментов синтеза церамидов по сфингомиелиназмому пути. Эти изменения могут способствовать аккумуляции церамидов, запуская многие патологические процессы, ассоциированные с атеросклерозом. Наблюдаемое увеличение экспрессии генов ферментов может быть обусловлено рядом причин: избыток жирных кислот, гипоксия, воспаление, активация TLR4-рецепторов на адипоцитах. Кроме повышенной экспрессии ферментов биосинтеза церамидов, в ЭЖТ пациентов с ИБС выявлено увеличение уровня мРНК ферментов катаболизма церамидов. Регуляция метаболизма за счет экспрессии ферментов их синтеза и распада представляет собой привлекательную терапевтическую стратегию уменьшения уровня церамидов в плазме и периферических тканях, в т.ч. в сердце и сосудах, и имеет огромные перспективы для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых патологий.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-15-20007 "Церамидный профиль локальных жировых депо сердца: клинико-патогенетическое значение и терапевтический потенциал" https://rscf.ru/project/22-15-20007/ и средств Министерства науки и высшего образования Кузбасса.