Клеточная гетерогенность и клональный гемопоэз клеток иммунной системы при атеросклерозе

Парадигма метаболического синдрома как движущего фактора атеросклероза все меньше привлекает внимание, ввиду совокупности убедительных экспериментальных и клинических исследований, указывающих на фундаментальную роль воспалительного компонента в атерогенезе [1]. Воспаление не отменяет липидный фактор риска (ФР), а  скорее выступает связующим звеном, за счет ряда сигнальных метаболических путей, между липидным и другими традиционными ФР атеросклероза и его осложнений [2][3].

В атерогенезе участвует врожденный (неспецифический) и приобретенный (адаптивный, специфический) иммунитет. Так, оценка С-реактивного белка с помощью высокочувствительного анализа, известного как hsCRP, является надежным и клинически оправданным показателем общего врожденного иммунного статуса по отношению к риску сердечно-сосудистых осложнений, вызванных атеросклеротическим поражением [4].

Помимо врожденного иммунитета, который в значительной степени зависит от цитокинов и макрофагов, в атерогенезе немаловажную роль играет адаптивное звено иммунного ответа. Однако адаптивный иммунитет демонстрирует двойственную природу, т.е. может играть как атеропротективную роль, например, за счет Т-хелперов и регуляторных Т-клеток, так и атерогенную [1][5]. Подобная неопределенность роли адаптивного иммунитета вызвала серьёзные споры в научном сообществе [6][7].

В историческом аспекте оценка гетерогенности иммунных клеток при атеросклерозе появляется в середине 80-х годов с развитием технологии окрашивания двумя маркерами [8]. Современные модификации иммуногистохимических исследований позволяют использовать до 16 маркеров [9].

Применение проточной цитометрии, и, в особенности, масс-цитометрии (цитометрии по времени пролета, CyTOF) с возможностью использования до 40 маркеров, значительно расширило картину клеточной гетерогенности атеросклероза [10-12]. А с появлением технологии секвенирования РНК единичных клеток (single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq), а  также секвенирования Ти В-лимфоцитарных рецепторов (TCR, BCR) значительно расширилась возможность обнаруживать новые типы клеток, оценивать их происхождение и в целом определять соотношение субпопуляций клеток.

Наряду с этим, широкое применение полногеномного секвенирования в медицинской практике позволило выявить такой ранее неизвестный ФР сердечно-сосудистых осложнений, как клеточный гемопоэз, который имеет сильное влияние на риск инфаркта миокарда и инсульта, даже по сравнению с традиционными ФР. Данный обзор посвящен новым направлениям исследований атеросклероза и риска сердечно-сосудистых осложнений.

Клеточная гетерогенность при атеросклерозе

Современная картина атерогенеза представляет собой многостадийный процесс. Эндотелий сосудов противостоит адгезии лейкоцитов, однако в атерогенной среде эндотелиальные клетки экспрессируют молекулы адгезии, что обеспечивает роллинг лейкоцитов вдоль сосудистой стенки, а  за счет хемокинов их дальнейшему хемотаксису в интиму артерий.

Первичным звеном в цепочке последующих событий атеросклероза является рекрутинг лейкоцитов. Однако, ввиду незавершенности трансмиграции, мононуклеарные лейкоциты, находясь в транзитной зоне (в интиме), а ктивируются и приступают к активной пролиферации, фагоцитируя окисленные липопротеиды низкой плотности с последующей трансформацией в пенистые клетки [13]. Гибель мононуклеарных фагоцитов в интиме в совокупности с дефектным их эффероцитозом способствуют формированию некротического (липидного) ядра атеросклеротической бляшки [14].

В то время как клетки врожденного иммунитета способствуют аккумулированию липидов, Ти В-лимфоциты принимают активное участие в его регуляции внутри интимы [15][16]. Кроме того, а ктивное участие в поглощении липидов начинают принимать и клетки медии [17][18]. Исследования по оценке происхождения клонов пенистых клеток показали, что многие пенистые клетки происходят из гладкомышечных клеток, которые подвергаются метаплазии, становясь макрофагоподобными [19].

Кооперация клеточных компонентов в атеросклеротической бляшке запускает активную выработку провоспалительных цитокинов, которые поддерживают и усиливают локальное воспаление. Однако атеросклероз не является прогредиентно необратимым дегенеративным процессом, а  скорее имеет динамичную и прерывистую эволюцию атероматозных образований, с эпизодами системного и регионального воспаления, провоцирующего усиление миграции и пролиферации клеток [20-22]. Таким образом, клеточная популяция атеросклеротической бляшки может отличаться по времени: увеличиваться в кризисные моменты и снижаться в фазах относительного затишья.

Появление таких передовых технологий, как сортировка клеток с активированной флуоресценцией (fluorescence-activated cell sorting, FACS) и секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq), раскрыло более высокую, чем представлялось ранее, степень гетерогенности иммунных клеточных популяций атеросклеротической бляшки (рис. 1) [23-27]. Подобные пилотные исследования выполняют поисковую роль и нам еще предстоит выяснить функциональное значение новых идентифицированных типов клеток, участвующих в атерогенезе.

В крови превалируют покоящиеся CD4⁺ Т-лимфоциты, экспрессирующие ингибиторы Т-клеток (KLF2, TXNIP). В атеросклеротической же бляшке CD4+ Т-лимфоциты экспрессируют, главным образом, факторы их активации, такие как NFATC2, FYN и ZAP70, а  также связанные с их цитотоксичностью гранзимы (GZMA, GZMK) [26]. Среди CD4⁺ Т-лимфоцитов, присутствующих в атеросклеротической бляшке, обнаружено несколько субпопуляций [28].

Т-лимфоциты с активной цитотоксической ролью подразделяются на две отдельные субпопуляции, CD4⁺CD28^null T-клетки, экспрессирующие перфорин (PRF1), но не CD28, которые, как известно, весьма устойчивы к апоптозу [29] и имеют характер клональной инвазии вплоть до полной моноклональной популяции CD28^null T-лимфоцитов [30]. Увеличение данной субпопуляции в крови ассоциировано с острым коронарным синдромом [31]. При этом обнаруживается другая небольшая цитотоксическая субпопуляция, которая, напротив, а ктивно экспрессирует CD28, но не PRF1.

Предполагается, что CD28^null и CD28⁺ Т-клетки происходят независимо друг от друга, однако существует и другая версия, при которой CD28⁺ Т-лимфоциты являются предшественниками CD28^null Т-клеток, которые в ходе активации утрачивают CD28 [32]. При этом CD28⁺ Т-лимфоциты обладают высокой пролиферативной способностью по сравнению с CD28^null T-лимфоцитами [33]. Вероятнее всего, CD28⁺ Т-лимфоциты и обеспечивают высокую клональную инвазию с последующей их активацией и утратой CD28.

Кроме того, в атеросклеротической бляшке хорошо обнаруживаются наивные, регуляторные и центральной памяти CD4⁺ Т-клетки, экспрессирующие, главным образом, IL7R, LEF1 и SELL [29]. Небольшая часть Т-лимфоцитов является истощенной с активной экспрессией EOMES, PDCD1 и LAG3 [26]. Численность остальных типов CD4⁺ Т-клеток столь невелика, что в настоящий момент трудно оценить их принадлежность ввиду ограничений существующих технологий.

Неожиданной находкой явилось то, что цитотоксические CD8⁺ Т-киллеры более значительно преобладают в атеросклеротической бляшке (46%) по сравнению с циркулирующими в крови (10%), чем ожидалось ранее [26]. В атеросклеротической бляшке обнаруживаются и CD8⁺ Т-лимфоциты с цитотоксической ролью, а ктивно экспрессирующие гранзимы А и К [28], а  также ранее неизвестную в отношении атеросклероза CD8⁺ субпопуляцию, экспрессирующую CD69 [28][34].

Мембранный рецептор CD69 является антигеном ранней активации лимфоцитов [35]. Вероятно, это пул недавно мигрировавших цитотоксических CD8⁺ Т-лимфоцитов, сохранивших данный маркер активации. Среди цитотоксических CD8⁺ Т-лимфоцитов выделяется субпопуляция, а ктивно экспрессирующая гранзим В (GZMB), гранулизин (GNLY) и ряд других молекул (TBX21, NKG7, ZNF683 и CX3CR1), но лишенных CD69. Вероятнее всего, что это вторая стадия развития цитотоксических CD8⁺ Т-лимфоцитов с видоизменением набора ферментов с утратой CD69. Однако неясно, по каким причинам они могут персистировать до стадии истощения (экспрессия PD-1, EOMES и LAG-3), т.к. не всегда обнаруживаются [26][28].

Макрофаги также подразделяются на ряд специфических субпопуляций. Одна из субпопуляций макрофагов находится в фазе активации (HLA-DRA, CD74). После активации часть макрофагов принимает участие в воспалительном процессе с регуляцией активности оксидоредуктазы (CYBA) и с ингибитором металлопротеаз TIMP1. Другая субпопуляция провоспалительных макрофагов, напротив, экспрессирует гены JUNB, NFKBIA, и, в особенности, имеет высокую экспрессию MALAT1.

Известно, что MALAT1 представляет собой длинную некодирующую РНК и ранее демонстрировала ассоциацию с атеросклерозом [36]. Кроме того, MALAT1 тесно связана с развитием и прогрессированием онкологических заболеваний [37][38]. Данная находка указывает на то, что формируется отдельная субпопуляция макрофагов, которая выполняет только воспалительную роль и не участвует в поглощении липидов, поскольку MALAT1 показатель терминальной стадии клетки [39], в связи с чем в ряде случаев подобные клетки отбраковываются из анализа данных [28].

Помимо воспалительных макрофагов, отдельно выделяется субпопуляция макрофагов, поглощающих (экспрессируют APOC1 и APOE) и аккумулирующих липиды (PLIN2), постепенно трансформируясь в пенистые клетки. Эти макрофаги, напротив, имеют очень низкий уровень провоспалительных сигналов (IL-1, IFN), что в целом согласуется с противовоспалительной природой пенистых клеток. Кроме макрофагов и пенистых клеток (ABCG-позитивные), поглощающих липиды, обнаруживается и субпопуляция дендритных клеток (CD1c-позитивные), экспрессирующих CLEC10A и FCER1A. Кластерный анализ также показал неоднозначную субпопуляцию клеток, напоминающую дублеты между моноцитами и Т-клетками [40], которые экспрессируют как маркеры Т-лимфоцитов (CD3E, GNLY, FOXP3, CD2), так и миелоидных клеток (CD14, CD68, KIT) [28]. Функциональное значение подобных Т-клеточномоноцитарных комплексов еще предстоит выяснить.

Клональный гемопоэз с неопределенным потенциалом в структуре атеросклероза

Как известно, в онтогенезе человека возникают соматические мутации в гемопоэтических стволовых клетках костного мозга, которые нередко могут приводить к лейкозам [41][42]. Исследования, направленные на поиск драйверных генов лейкоза, обнаружили, что в контрольных выборках также наблюдается некоторое количество циркулирующих клонов лейкоцитов, несущих соматические мутации в ряде генов, включая драйверные гены лейкемии. Поскольку эти мутации не блокируют гемопоэтическую дифференцировку, пролиферация мутантных клонов происходит свободно.

Показана прямая корреляция между количеством мутантных клонов и возрастом человека, доля которых может быть выше 10%. Кроме того, известно, что к 70 годам их доля составляет не менее 2% [43][44]. Данное парафизиологическое состояние известно как клональный гемопоэз с неопределенным потенциалом (КГНП).

Как и ожидалось, чем выше уровень КГНП, тем выше риск развития лейкоза и ниже выживаемость. Однако обнаружилось, что высокий уровень КГНП также значительно увеличивает риск инфаркта миокарда и инсульта по сравнению с традиционными ФР сердечно-сосудистых заболеваний (за исключением возраста) [44]. Именно потому, что нельзя предсказать будет ли в результате КГНП острое сосудистое событие или сформируется лейкоз, данное явление можно назвать патоантагонистическим плейотропизмом и оно не является частным случаем дистропии или обратной коморбидности, т.к. одно состояние не отменяет другое.

Для понимания КГНП необходимо разобрать несколько терминов, пересекающихся с ним. Фракция альтернативного аллеля (variant allele fraction, VAF) — процентное соотношение альтернативного аллеля к общему количеству просеквенированных молекул ДНК методами секвенирования нового поколения, терминологически говоря доля ридов альтернативного аллеля по покрытию. Классическим примером является обнаружение низкомозаичных соматических мутаций в онкогенах, представляющих собой "скрытую угрозу" при терапии онкологических заболеваний, т.к. они могут дать толчок развитию новых онкоклонов с селективным преимуществом.

Клональный гемопоэз — появление в костном мозге клонов, несущих соматические мутации, способных к клональной экспансии. Идиопатические цитопении с неопределенным значением — ряд необъяснимых цитопений, которые не соответствуют диагностическим критериям миелодиспластического синдрома и других гематологических нарушений, и не имеют установленного клонального происхождения. С другой стороны, под термином идиопатические дисплазии с неопределенным потенциалом понимаются дисплазии лейкоцитарной формулы, т.е. нарушение соотношения клеток крови, не сопровождающееся цитопенией и с не установленным клональным гемопоэзом.

Клональная цитопения с неопределенным значением отличается от КГНП тем, что наблюдается, напротив, низкий уровень соматических мутаций (VAF <2%), а ссоциированных с гематологическими неоплазиями, сопровождаясь необъяснимыми цитопениями, не подпадающими под диагностические критерии миелодиспластического синдрома и других гематологических нарушений.

В целом плейотропизм КГНП напоминает моноклональную гаммапатию с неопределенным значением, при которой высокий уровень парапротеина, также случайно выявленного, способен повышать риск множественной миеломы, однако наличие некоторого уровня парапротеина встречается повсеместно. Таким образом, подобные состояния в некотором роде можно отнести к доброкачественным, однако, как и в онкологической практике, "доброкачественный" не тождественно "безвредный".

Доказательства важности КГНП для ССЗ, вероятнее всего, в будущем приведет к пересмотру предсказательных оценок риска сердечно-сосудистых осложнений. Впрочем, приставка "неопределенный потенциал" отражает суть нашей текущей несостоятельности предсказать судьбу подобных мутантных клонов, которые могут привести либо к сердечно-сосудистым осложнениям, либо к лейкозу [45][46].

Гемопоэз является ключевым связующим фактором между атерогенезом и стимулами окружающей среды [47]. Стресс, нарушение сна, травмы, инфекции стимулируют гемопоэз в костном мозге, в особенности лейкоцитов, которые в силу своей специфики будут активно "заселять" атеросклеротические бляшки, способствуя тем самым воспалению [47][48]. Вместе с тем экстрамедуллярный гемопоэз и пул лейкоцитов селезенки также могут мобилизоваться в стрессовых ситуациях.

Экспериментальные работы на модельных животных показывают, что смоделированная КГНП у мышей путем создания нокаутного пула клонов по гену Tet2 на фоне ФР атеросклероза (инактивированный Ldlr) приводит к ускоренному росту атеросклеротической бляшки [44][49]. Анализ РНК-секвенирования клонов, нокаутных по гену Tet2, показал повышенную экспрессию проатерогенных медиаторов, включая интерлейкин-1-бета и интерлейкин-6 [41].

Список генов, способных вызывать КГНП, в настоящее время пополняется и на данный момент он включает DNMT3A, TET2, ASXL1, PPMD1, SF3B1, SRSF2, TP53 и JAK2 [50-54]. Их особенностью является ассоциация с развитием лейкоза. Таким образом, открытия в области изучения КГНП показали гораздо более сильную взаимосвязь между атерогенезом и онкогенезом, о которой ранее и не предполагали.

Заключение

Внедрение методов секвенирования единичных клеток, в особенности с использованием методов селекции антителами, расширяет наше представление о клеточной гетерогенности атеросклероза. С накоплением новых данных можно ожидать детализации атласа клеток иммунной системы при атеросклерозе, а  также эволюцию представлений о них (патоонтогенетическую трансформацию) и понимание взаимоотношений. Наряду с этим, непрекращающаяся в своем развитии технология секвенирования генома и ее широкая доступность ставят новые задачи перед клиницистами, т.к. они все чаще будут наблюдать в своей практике КГНП.

Отсюда возникает множество вопросов, например, существуют ли мажорные мутации при КГНП, способные привести к определенному клиническому фенотипу (инфаркту миокарда или лейкозу), или в рамках омнигенетической концепции существует генетическая гетерогенность, которая не имеет фенотипически предсказательной силы? Сыграет ли существенную роль персонификация тактики лечения в зависимости от конкретного мутантного клона или, напротив, стандартизация клинических рекомендаций не окажет существенного прогресса в терапии и необходима персонификация? И в целом есть ли необходимость в элиминации мутантных клонов, и если да, то как и каким образом нужно проводить последующее диагностическое сопровождение пациента? Будет ли это выполняться по конкретно выявленному варианту или по расширенному списку мутаций, ввиду риска упущения новых мутантных клонов, или не будет альтернативы кроме как секвенировать весь геном? В настоящее время разрабатываются рекомендации по тактике ведения пациентов с КГНП, однако они сводятся, главным образом, к включению в группу риска с усиленным наблюдением [47].

Отношения и деятельность. Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 22-2500745.