Опыт молекулярно-генетической диагностики гипертрофической кардиомиопатии с использованием нанопорового секвенирования ДНК

Цель. Оценить возможность применения технологии секвенирования третьего поколения компании Oxford Nanopore Technologies для диагностики гипертрофической кардиомиопатии.

Материал и методы. Обследованы 12 пациентов с установленным диагнозом “гипертрофическая кардиомиопатия”: 9 женщин и 3 мужчин, в возрасте от 18 до 67 лет. ДНК-библиотека для секвенирования была приготовлена на основе продуктов Long-Range ПЦР, охватывающих полную последовательность генов MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3 и TPM1 (по протоколу “PCR barcoding amplicons (SQKLSK109)”). Секвенирование выполнено на платформе MinION компании Oxford Nanopore Technologies (UK). Биоинформатические алгоритмы обработки данных включали “Guppy v.5.0.7”, “Nanopolish” и “Clairvoyante”. Выявленные генетические варианты были подтверждены с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Результаты. Получены данные о полной последовательности пяти основных генов саркомерных белков гипертрофической кардиомиопатии. Из восьми вариантов в генах MYH7, MYBPC3 и TNNT2, выявленных в результате мономолекулярного секвенирования и потенциально являющихся причиной заболевания, были подтверждены с помощью секвенирования по Сэнгеру лишь четыре (p.Arg243Cys, p.Tyr609Asn, p.Arg870His в гене MYH7 и p.Lys985Asn гене MYBPC3). Проведен каскадный скрининг патогенного варианта p.Arg870His в гене MYH7. Установлено наличие гетерозиготного носительства у одной из дочерей пробанда.

Заключение. Технология мономолекулярного секвенирования имеет потенциал для диагностики гипертрофической кардиомиопатии при условии повышения точности секвенирования ДНК, а также оптимизации и упрощения биоинформатических алгоритмов идентификации генетических вариантов.

1. Semsarian C, Ingles J, Maron MS, et al. New perspectives on the prevalence of hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2015;65(12):1249-54. doi:10.1016/j.jacc.2015.01.019.

2. McKenna WJ, Judge DP. Epidemiology of the inherited cardiomyopathies. Nat Rev Cardiol. 2021;18(1):22-36. doi:10.1038/s41569-020-0428-2.

3. Repetti GG, Kim Y, Pereira AC, et al. Discordant clinical features of identical hypertrophic cardiomyopathy twins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(10):e2021717118. doi:10.1073/pnas.2021717118.

4. Ingles J, Goldstein J, Thaxton C, et al. Evaluating the Clinical Validity of Hypertrophic Cardiomyopathy Genes. Circ Genom Precis Med. 2019;12(2):e002460. doi:10.1161/CIRCGEN.119.002460.

5. Elliott P. M., Anastasakis A. A., Borger M., et al. Рекомендации ESC по диагностике и лечению гипертрофической кардиомиопатии 2014. Российский кардиологический журнал. 2015;(5):7-57. doi:10.15829/1560-4071-2015-5-7-57.

6. Deamer D, Akeson M, Branton D. Three decades of nanopore sequencing. Nat Biotechnol. 2016;34(5):518-24. doi:10.1038/nbt.3423.

7. Ameur A, Kloosterman WP, Hestand MS. Single-Molecule Sequencing: Towards Clinical Applications. Trends Biotechnol. 2019;37(1):72-85. doi:10.1016/j.tibtech.2018.07.013.

8. Dainis A, Tseng E, Clark TA, et al. Targeted Long-Read RNA Sequencing Demonstrates Transcriptional Diversity Driven by Splice-Site Variation in MYBPC3. Circ Genom Precis Med. 2019;12(5):e002464. doi:10.1161/CIRCGEN.119.002464.

9. Hathaway J, Heliö K, Saarinen I, et al. Diagnostic yield of genetic testing in a heterogeneous cohort of 1376 HCM patients. BMC Cardiovasc Disord. 2021;21(1):126. doi:10.1186/s12872-021-01927-5.

10. Loman NJ, Quick J, Simpson JT. A complete bacterial genome assembled de novo using only nanopore sequencing data. Nat Methods. 2015;12(8):733-5. doi:10.1038/nmeth.3444.

11. Luo R, Sedlazeck FJ, Lam TW, Schatz MC. A multi-task convolutional deep neural network for variant calling in single molecule sequencing. Nat Commun. 2019;10(1):998. doi:10.1038/s41467-019-09025-z.

12. Рыжкова О. П., Кардымон О. Л., Прохорчук Е. Б. и др. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). Медицинская генетика. 2019;18(2):3-23. doi:10.25557/2073-7998.2019.02.3-23.

13. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-24. doi:10.1038/gim.2015.30.

14. Kelly MA, Caleshu C, Morales A, et al. Adaptation and validation of the ACMG/AMP variant classification framework for MYH7-associated inherited cardiomyopathies: recommendations by ClinGen’s Inherited Cardiomyopathy Expert Panel. Genet Med. 2018;20(3):351-9. doi:10.1038/gim.2017.218.

15. Walsh R, Mazzarotto F, Whiffin N, et al. Quantitative approaches to variant classification increase the yield and precision of genetic testing in Mendelian diseases: the case of hypertrophic cardiomyopathy. Genome Med. 2019;11(1):5. doi:10.1186/s13073-0190616-z.

16. ClinVar. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/.

17. Gruen M, Gautel M. Mutations in beta-myosin S2 that cause familial hypertrophic cardiomyopathy (FHC) abolish the interaction with the regulatory domain of myosinbinding protein-C. J Mol Biol. 1999;286(3):933-49. doi:10.1006/jmbi.1998.2522.

18. Cuda G, Fananapazir L, Epstein ND, et al. The in vitro motility activity of beta-cardiac myosin depends on the nature of the beta-myosin heavy chain gene mutation in hypertrophic cardiomyopathy. J Muscle Res Cell Motil. 1997;18(3):275-83. doi:10.1023/a:1018613907574.

19. Rayment I, Holden HM, Sellers JR, et al. Structural interpretation of the mutations in the beta-cardiac myosin that have been implicated in familial hypertrophic cardiomyopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(9):3864-8. doi:10.1073/pnas.92.9.3864.

20. Nishi H, Kimura A, Harada H, et al. A myosin missense mutation, not a null allele, causes familial hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 1995;91(12):2911-5. doi:10.1161/01.cir.91.12.2911.

21. Tanjore RR, Sikindlapuram AD, Calambur N, et al. Genotype-phenotype correlation of R870H mutation in hypertrophic cardiomyopathy. Clin Genet. 2006;69(5):434-6. doi:10.1111/j.1399-0004.2006.00599.x.

22. Capek P, Vondrasek J, Skvor J, et al. Hypertrophic cardiomyopathy: from mutation to functional analysis of defective protein. Croat Med J. 2011;52(3):384-91. doi:10.3325/cmj.2011.52.384.

23. Laredo R, Monserrat L, Hermida-Prieto M, et al. Beta-myosin heavy-chain gene mutations in patients with hypertrophic cardiomyopathy. Rev Esp Cardiol. 2006;59(10):1008-18. doi:10.1157/13093977.

24. Hershkovitz T, Kurolap A, Ruhrman-Shahar N, et al. Clinical diversity of MYH7-related cardiomyopathies: Insights into genotype-phenotype correlations. Am J Med Genet A. 2019;179(3):365-72. doi:10.1002/ajmg.a.61017.

25. Bashyam MD, Savithri GR, Gopikrishna M, et al. A p.R870H mutation in the beta-cardiac myosin heavy chain 7 gene causes familial hypertrophic cardiomyopathy in several members of an Indian family. Can J Cardiol. 2007;23(10):788-90. doi:10.1016/s0828282x(07)70828-0.