Клинико-морфологическое и молекулярно-биологическое исследование миокарда у пациентов с COVID-19

С первых дней пандемии новой коронавирусной инфекции (COVID-19) появились сообщения об увеличении уровня сердечных биомаркеров (сердечного тропонина и натрийуретических пептидов) у госпитализированных пациентов. Со временем стало очевидным, что повреждение миокарда, оцениваемое на основании анализа биомаркеров, а именно на основании повышения концентрации сердечного тропонина, связано с тяжелым течением инфекции и неблагоприятным прогнозом [1]. В то время как ранние рекомендации различных кардиологических обществ [2][3] предлагали ограничить тестирование сердечных биомаркеров пациентам с COVID-19  и симптомами острого коронарного синдрома или сердечной недостаточности, многие медицинские учреждения продолжали использовать биомаркеры повреждения миокарда как простой и недорогой инструмент для стратификации риска.

Частота повреждения миокарда среди госпитализированных пациентов с COVID-19 варьирует в широких пределах от 13 до 41%, что обуславливает высокую смертность от сердечно-сосудистых осложнений [4]. Тем не менее частота развития миокардитов по данным текущих публикаций по-прежнему остается весьма неопределенной [5]. При этом дифференциальный диагноз причины повышения уровня тропонина при COVID-19 не всегда очевиден. Наличие миокардита не всегда может быть подтверждено прижизненными исследованиями, даже магнитнорезонансной томографией, что делает крайне актуальным вопрос морфологической диагностики для оценки истинных механизмов поражения сердца.

Цель исследования: оценить морфологические изменения миокарда у пациентов, умерших от COVID-19, и сопоставить их с прижизненным уровнем сердечных биомаркеров.

Материал и методы

В анализ включено 420 историй болезни пациентов с COVID-19, лечившихся в ФГБУ “НМИЦ им. В.А. Алмазова” летом 2020г, и 77 аутопсийных исследований умерших от COVID-19 в тот же период. У всех больных вирусная инфекция была подтверждена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в мазке из носа и зева при жизни и в тканях трахеи, бронха и легких посмертно (нативный материал). Всем пациентам была проведена компьютерная томография (на томографе Somatom Defenition 128 срезов Siemens) и стандартное лабораторное обследование с оценкой клинического анализа крови, уровня С-реактивного белка, прокальцитонина, Д-димера, ферритина и тропонина I. Также проводились электрокардиографическое и эхокардиографическое исследования. Среди умерших пациентов было 34 женщины и 43 мужчины в возрасте от 41 до 90 лет. Все больные умерли от острого респираторного дистресс синдрома на фоне двусторонней сливной вирусной бронхопневмонии на сроке от 1 до 57 сут. после госпитализации. В каждом случае забирался миокард из стенок 4 камер сердца и межжелудочковой перегородки. Проводилось традиционное гистологическое исследование миокарда с окраской гематоксилином и эозином, а в случаях выявления негнойной воспалительной инфильтрации миокарда (в 15 из 77) — иммуногистохимический анализ с антителами к CD3, CD45, CD8, CD68, CD34, Ang1, фактору фон Виллебранда (VWF), VEGF, HLA-DR, MНC1, C1q, VP1 энтеровирусов. Морфометрический анализ включал подсчет среднего количества клеток воспалительного инфильтрата на 1 мм2 и оценку экспрессии HLA-DR, MНC1, C1q, Ang1, VWF и VEGF в баллах (1 — экспрессия на единичных клетках и сосудах, 2 — на 1/3 клеток, 3 — на 1/2-2/3 площади препарата, 4 — на всех исследуемых клетках).

В случаях вирусного миокардита, подтвержденных иммуногистохимическим анализом (в 8 случаях), содержание геномной рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса SARS-CoV-2 в образцах оценивали, используя двухшаговый метод цифровой ПЦР после обратной транскрипции (ОТ-цПЦР) в соответствии с рекомендациями СDС центра Китая для гена N и клиники Charite для гена E [6, 7]. Препараты РНК выделяли из пяти последовательных срезов FFPE блоков ткани миокарда левого желудочка, используя наборы AllPrep DNA/RNA FFPE Kit (QiaGen, 80234). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, K1632) со специфическими праймерами и случайными олигогексамерами. Реакцию цифровой капельной ПЦР проводили с использованием смеси ddPCR Supermix for Probes (Bio-Rad, #1863026). В качестве положительного контроля выделения применяли ОТ-цПЦР мРНК гена β-актина.

Статистический анализ проводился с помощью Statistica v.10 software (StatSoft, Россия). Для нормальных распределений значимость различий в количественных характеристиках интерпретировали с использованием t-критерия Стьюдента при требуемом уровне значимости р<0,05. Корреляционный анализ был выполнен с помощью U-критерия Манна-Уитни и последующей оценки достоверности с помощью таблицы критических значений U-критерия при требуемом уровне значимости р<0,05.

Результаты

Средний возраст пациентов, лечившихся в Центре от коронавирусной инфекции, составил 66,7±1,1 лет, умершие пациенты были на 10 лет старше выживших (табл. 1). Наиболее частыми сопутствующими заболеваниями были артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца (ИБС) и сахарный диабет.

При анализе анамнестических данных ИБС документирована у 43 умерших пациентов (56%), у 49 (64%) выявлена артериальная гипертензия, у 20 (26%) — сахарный диабет, у 9 (12%) — хроническая цереброваскулярная болезнь с острым нарушением мозгового кровообращения, у 12 (16%) — онкологические заболевания, у 3 (4%) — хроническая обструктивная болезнь легких, у 1 — хроническая ревматическая болезнь сердца (2%), у 1 (2%) — ВИЧинфекция. Среднее количество койко-дней у умерших пациентов было 14,7±2,5.

У умерших и выживших пациентов отмечены значимые различия по следующим показателям: С-реактивный белок, D-димер, ферритин, прокальцитонин, процент поражения лёгочной паренхимы при компьютерной томографии (t критерий Стьюдента при требуемом уровне значимости р<0,05). У большинства больных наблюдалась лимфопения, как среди выписанных, так и среди умерших.

У большинства больных с миокардитами (75%), подтвержденными иммуногистохимическим анализом, выявлено повышение тропонина I. Эхокардиографическое исследование проводилось только в 25% случаев. Лимфопению мы наблюдали в 7 из 8 случаев вирусного миокардита. Статистически достоверно процент поражения легочной ткани по данным компьютерной томографии у пациентов с миокардитом был выше, чем у всех пациентов (71,1±12,3% vs 44,7±2,0% при р<0,05%).

При гистологическом исследовании сердца у 33 (43%) больных наблюдались множественные кровоизлияния в миокард (рис. 1 а), у 8 (10%) — тромбы в интрамуральных артериях, у 13 (17%) — некоронарогенные некрозы, у 7 (9%) — выраженный отек стромы с отложением фибрина в интерстиции (рис. 1 б), у 11 (14%) — скопления макрофагов в строме, у 3 (4%) — гнойничковый миокардит (рис. 1 в), у 4 (5%) — инфильтративный васкулит, у 1 (1%) — лимфоцитарный перикардит, у 7 (9%) — фрагментация мышечных волокон, у 4 (5%) — лейкоцитарные стазы, у 8 (10%) — очаговое плазматическое пропитывание стенок интрамуральных артерий, у 20 (26%) — выраженная гипертрофия миокарда, у 2 (3%) — липоматоз, у 14 (18%) — постинфарктные рубцы, у 5 (6%) — геморрагический инфаркт миокарда (ИМ) (рис. 1 г), у 10 (13%) — ишемический ИМ (рис. 1 д; в 1 случае замедленной организации). Лимфоцитарный активный миокардит был заподозрен в 15 (19%) случаях (рис. 1 е).

При этом в 9 из 15 случаев наблюдались нарушения ритма и проводимости (фибрилляция предсердий в 4 случаях, предсердная экстрасистолия в 1 случае, желудочковая экстрасистолия в 1 случае, неполная блокада правой ножки пучка Гиса — в 4, полная блокада передне-верхнего разветвления левой ножки пучка Гиса — в 2). У 1 пациента электрокардиографическое исследование не успели выполнить (табл. 2).

В 43 случаях (56%) в миокарде и перикарде были выявлены крупные полиморфные клетки, располагающиеся в зоне сосудов (рис. 1 ж, з, и).

При иммуногистохимическом исследовании лимфоцитарный активный миокардит в соответствии с международными критериями [8] был подтвержден только в 8 (53%) из 15 случаев, что составило 10% от общего числа умерших пациентов (табл. 3).

При этом в 7 из 8 случаев доказанного миокардита наблюдались нарушения ритма и проводимости.

В группе пациентов с подозрением на лимфоцитарный миокардит не было выявлено значимых корреляций между воспалительными биомаркерами и наличием или отсутствием иммуногистохимически подтвержденного миокардита (табл. 4, рис. 2).

При иммуногистохимическом исследовании в 6 из 8 случаев была выявлена реакция гуморального иммунитета с экспрессией C1q-компонента комплимента (рис. 3 а), а в 5 из 8 — наличие капсидного VP1-антигена энтеровирусов преимущественно в стенках сосудов (рис. 3 б). На крупных полиморфных клетках в зоне сосудов определялась экспрессия CD34 (рис. 3 в). Только часть из этих клеток была макрофагами с экспрессией CD68 (рис. 3 г). Повышенное количество их (≥14/мм2) определялось в 3 из 8 случаев. При гистологическом и иммуногистохимическом исследовании мы не обнаружили выраженной диффузной лимфоцитарной инфильтрации миокарда. Максимальные очаговые инфильтраты насчитывали 21-37 CD3+T-лимфоцитов/мм2. Ни в одном случае миокардита не было выявлено CD8+T-лимфоцитов. Во всех 8 случаях лимфоцитарного миокардита наблюдалась экспрессия фактора фон Виллебранда (VWF) на эндотелии сосудов (рис. 3 ж), ангиопоэтина Ang1 — на эндотелии и в саркоплазме кардиомиоцитов (рис. 3 з, и). Экспрессия сосудистого ростового фактора VEGF на эндотелии и в мышечных волокнах наблюдалась в 4 случаях, только на эндотелии — в 3 и отсутствовала в 1 случае (рис. 3 д, е).

В целом у умерших больных с коронавирусной инфекцией вне зависимости от наличия или отсутствия миокардита мы выявили экспрессию Ang1, VEGF, VWF. Причем Ang1 и VEGF в некоторых случаях экспрессировались не только в эндотелии, но и кардиомиоцитах.

Таким образом, наиболее частыми находками в сердце были активированный, пролиферирующий, гипертрофированный эндотелий сосудов и кровоизлияния в миокард. Лимфоцитарный миокардит был выявлен всего в 10% случаев (из 77). В 7 из 8 случаев он сопровождался нарушениями ритма и повышением уровня тропонина.

Ранее ФГУП “ВНИИМ им. Д. И. Менделеева” было принято участие в пилотных сличениях на высшем уровне точности Консультативного комитета по количеству вещества: метрология для химии и биологии CCQM-P199b “Измерения числа копий РНК SARS-CoV-2” [9]. Результаты этих сличений подтвердили, что реализованная нами методика цифровой капельной ПЦР после обратной транскрипции обеспечивает возможность достоверного измерения концентрации копий последовательностей в составе генома SARS-CoV-2 на уровне 10 мкл-1. Однако в результате исследований препаратов РНК, выделенных из FFPE препаратов ткани миокарда левого желудочка, нами не было обнаружено присутствия последовательностей генов N и E коронавируса.

Обсуждение

Анализируя данные аутопсийного исследования, нами показано, что самыми частыми изменениями при COVID-19 в миокарде являются дисэндотелиоз или эндотелиит сосудов (гипертрофия, гиперплазия,
дисплазия и повреждение эндотелия) с последующими кровоизлияниями. Varga Z, et al. [10] также описывают признаки эндотелиита в таких органах, как легкие, сердце, почки и кишечник, считая его прямым следствием вирусного поражения и воспалительной реакции в организме хозяина. По мнению авторов, COVID-19-эндотелиит может объяснить системные микроциркуляторные нарушения, возникающие в различных органах. На сегодняшний день известно, что SARS-CoV-2 — это вирус одноцепочечной РНК, чей S-белок внешней мембраны связывается с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (АПФ2) [11]. АПФ2 служит главным регулятором ренин-ангиотензиновой системы, метаболизируя сосудосуживающий и провоспалительный ангиотензин II (Ang II) до сосудорасширяющего пептида ангиотензина. Попав внутрь клетки, вирус использует механизм хозяина для трансляции РНК в полипептиды, включая РНК-зависимую РНК-полимеразу, которую вирус использует для репликации своей собственной РНК. После синтеза структурных белков и сборки частиц новый вирус высвобождается из клетки путем
экзоцитоза. В рамках активации врожденного иммунного ответа пораженные клетки-хозяева могут повреждаться [12]. АПФ2 экспрессируется в ряде тканей, включая сердце, легкие, гладкие мышцы кишечника, печень, почки и иммунные клетки. Вызванное вирусом подавление АПФ2 приводит к ослаблению его противовоспалительной функции и усилению провоспалительного эффекта ангиотензина II, что особенно негативно влияет на пациентов с артериальной гипертензией, ИБС и сахарным диабетом, которые в основном представлены в нашей выборке. Однако рецепторы АПФ2, наряду с легкими, в первую очередь экспрессируются эндотелиальными клетками, чем и обусловлена высокая тропность вируса к эндотелию. Интересно, что SARS-CoV-2 может напрямую инфицировать сконструированные органоиды кровеносных сосудов человека in vitro [13].

Ранее в исследовании аутопсийного материала пациентов, умерших от тяжелого острого респираторного синдрома, показано, что 7 (35%) из 20 сердец являются носителями коронавируса SARS-CoV [14][15]. Тем не менее на сегодняшний день существует лишь несколько работ, в которых выполнена идентификация геномной РНК SARS-CoV-2 в ткани миокарда [14][16].

Деградация одноцепочечной РНК при формалиновой фиксации тканей обычно более выражена, чем деградация дезоксирибонуклеиновой кислоты, что может приводить к ложноотрицательным результатам при поиске низкокопийных РНК-мишеней в подобных препаратах. Кроме того, исследование содержания нуклеиновых кислот в FFPE образцах было лимитировано ограниченным количеством материала. Для оценки количества материала, выделенного из FFPE блоков и пригодного для цПЦР (в т.ч. ОТ-цПЦР), выполняли измерения концентрации копий последовательности в составе однокопийного гена β-глобина и в составе мРНК гена β-актина. Концентрация копий последовательности гена β-глобина в  исследованных образцах составила 70±40 мкл^-1, мРНК β-актина — 3500±1400 мкл^-1.

Учитывая, что среднее содержание РНК на клетку составляет 20 пг (пикограмм), и принимая во внимание результаты оценки числа копий геномов, содержание пригодной для измерений методом цПЦР РНК в  выделенном материале составляет 700±400 пг/мкл. Согласно результатам Lindner D, et al. [17], в  33% аутопсийных образцах от пациентов с  подтвержденным SARS-CoV-2 вирусная нагрузка составила <1 тыс. копий на микрограмм выделенной тотальной РНК, тогда как нагрузка >80 тыс. копий на микрограмм РНК была обнаружена только для 20% образцов, т.е. типичное содержание РНК коронавируса в  препарате составляет порядка 0,001 копий на пикограмм выделенной тотальной РНК. В  4 из 8 исследованных нами методом ОТ-цПЦР препаратах амплификацию наблюдали только в  одной микрокапле из 15-20 тыс., что не позволило вынести заключение о присутствии РНК коронавируса. Однако данный результат может расцениваться как ложноотрицательный вследствие недостаточного количества РНК, доступного для проведения исследования.

В то же время в отчете о 104 пациентах с инфекцией COVID-19, у  которых развилась острая сердечная недостаточность и  которым была проведена эндомиокардиальная биопсия, только у  5 был положительный результат на геном SARS-CoV-2 в  ткани миокарда на фоне типичных признаков миокардита, включая выраженное воспаление, микрососудистые изменения, тромбоз и некроз миокарда [18].

В результате нашего исследования миокардит с  помощью иммуногистохимического анализа был подтвержден только у 10% пациентов (из 77), однако ОТ-цПЦР исследование не подтвердило достоверного присутствия РНК вируса SARS-CoV-2, которое бы свидетельствовало о  том, что миокардит вызван именно коронавирусной инфекцией. К  тому же в  упомянутых выше 4 случаях была определена выраженная экспрессия VP1 энтеровирусов, преобладающая в  сосудистых стенках (в  течение 15 лет в ФГБУ “НМИЦ им. В.А. Алмазова” используется методика иммуногистохимического исследования миокарда с  антителом к  VP1-энтеровирусов (DAKO), которая была отработана параллельно с  ПЦР в  биоптатах миокарда). На наш взгляд, возможна активация латентной энтеровирусной инфекции, описанной у  пациентов с  сердечно-сосудистыми заболеваниями, например, с  ИБС [19], как вследствие SARS-CoV-2 инфекции либо опосредовано за счет нарушения иммунного ответа. Кроме того, доказано, что эндогенные протеазы коронавирусов и  энтеровирусов имеют сходство по своей структуре и функциям. Эти протеазы обрабатывают свои вирусные полипротеины, и, таким образом, лекарственные средства, которые связываются с активным сайтом, потенциально могут воздействовать на обе вирусные группы [20].

Weckbach LT, et al. [5] не обнаружили РНК SARS-CoV-2 ни в  одной эндомиокардиальной биопсии с  помощью количественной ПЦР в  реальном времени, но выявили повышенное количество макрофагов.

Макрофаги являются ключевым компонентом врожденной иммунной системы и  основным источником провоспалительных цитокинов. Их активация осуществляется дезинтегрином и  доменом металлопротеиназы 17 (ADAM-17), трансмембранной протеазой, которая также отвечает за протеолиз и отщепление эктодомена ACE2 [21]. Наше исследование показало повышенное количество макрофагов при миокардите только в 3 из 8 случаев.

Ни в  одном случае миокардита мы не выявили выраженную диффузную лимфоцитарную инфильтрацию, а  CD8+T-киллеры вовсе отсутствовали в  миокарде в  отличие от описаний других авторов [22]. Возможно, это связано с  лимфопенией, которая была диагностирована у  большинства пациентов. Известно, что лимфопения возникает на ранней стадии заболевания и  является плохим прогностическим фактором. Она потенциально связана с  уменьшением количества CD4+ и  некоторых CD8+Т-клеток, что приводит к дисбалансу врожденного/приобретенного иммунного ответа, задержке выведения вируса и  гиперстимуляции макрофагов и  нейтрофилов. Соответствующая активация пути интерферона I типа имеет решающее значение для ослабления вируса и  сбалансированного иммунного ответа. Устойчивая активация иммунной системы у предрасположенных пациентов, таких как пожилые люди и пациенты с сердечно-сосудистыми заболеваниями, может привести к гемофагоцитозоподобному синдрому с  неконтролируемым усилением продукции цитокинов, что приводит к полиорганной недостаточности и смерти.

На наш взгляд, характерным морфологическим признаком COVID-19 является дисплазия эндотелиальных клеток, которая, очевидно, обусловлена нахождением в  них вирусных частиц. Действительно, электронная микроскопия показала частицы, соответствующие вирусу SARS-CoV-2 в  сердечной эндотелиальной клетке, но не в  кардиомиоцитах [23]. Кровоизлияния, тромбозы и некрозы миокарда представляют последствия дисфункции эндотелия.

У больных с коронавирусной инфекцией вне зависимости от наличия или отсутствия миокардита мы выявили экспрессию Ang1, VEGF, VWF. Причем Ang1 и VEGF в некоторых случаях экспрессировались не только в эндотелии, но и кардиомиоцитах. VEGF и Ang1 являются двумя основными ангиогенными факторами, которые исследуются для лечения ИМ. Известно, что кардиоспецифическая, вызванная гипоксией, коэкспрессия VEGF и Ang1 улучшает перфузию и функцию сердца за счет индукции ангиогенеза и пролиферации кардиомиоцитов, активации путей выживания и уменьшения апоптоза клеток [24]. Причем эта гипоксия может быть как следствием ишемии [25], так и быть гипоксемической [26].

Известно, что у мышей, подвергшихся гипоксии, повышение экспрессии VWF сопровождается наличием тромбов в сердце и легких [27], как и при COVID-19. VWF играет ключевую роль в адгезии и агрегации тромбоцитов в коронарных артериях со стенозирующими и нестабильными атеросклеротическими бляшками. Многочисленные исследования показали, что VWF является значимым прогностическим фактором неблагоприятных сердечных событий, включая смерть. Он повышается во время острого коронарного синдрома и служит не только маркером, но и фактически важным эффектором в патогенезе ИМ. Центральная роль VWF в тромбообразовании сделала его многообещающей целью для исследований новых антитромбозных методов лечения [28].

ADAMTS13 — фермент, расщепляющий VWF, снижает рекрутирование лейкоцитов и тромбоцитов и, таким образом, снижает тромбообразование и интенсивность воспалительной реакции. Рекомбинантный человеческий ADAMTS13 (rhADAMTS13) является новым кандидатом лекарственного препарата от ишемии/реперфузионного повреждения и показал краткосрочные преимущества на мышиных моделях повреждения миокарда, но долгосрочные результаты не исследовались [29].

У большинства пациентов с доказанными миокардитами мы наблюдали нарушения сердечного ритма в виде неполной блокады правой ножки пучка Гиса, полной блокады передне-верхнего разветвления левой ножки пучка Гиса, фибрилляции или экстрасистолии предсердий, у одного — желудочковую экстрасистолию (в ассоциации с острым ИМ). На наш взгляд, эти нарушения ритма нельзя объяснить только наличием миокардита. Описаны несколько причин: 1) гипокалиемия или гипомагниемия в результате самого заболевания (например, диареи), особенно, у тяжелобольных, либо при определенных видах лечения, таких как мочегонные средства; 2) фармакотерапевтические препараты, перепрофилированные для лечения COVID-19 с риском удлинения интервала QT и torsades de pointes; 3) за счет прямого электрофизиологического воздействия цитокинов на миокард [30]; 4) быстрое ухудшение функции почек и электролитные нарушения [31].

Теперь мы знаем, что люди с наибольшим риском смерти — это пожилые люди (в нашем исследовании средний возраст умерших был 71 год), с сопутствующими сердечно-сосудистыми заболеваниями. Острые коронарные события, как в наших 19% случаев, могут быть результатом резкого увеличения потребности миокарда в кислороде, вызванного инфекцией, аналогично ИМ 2 типа. С другой стороны, циркулирующие цитокины, высвобождаемые во время тяжелого системного воспалительного стресса, могут привести к нестабильности и разрыву атеросклеротической бляшки. Точно так же пациенты с сердечной недостаточностью склонны к декомпенсации гемодинамики во время стресса от тяжелых инфекционных заболеваний [32].

Клеточные и экспериментальные модели инфекции SARS-CoV-2 на животных, в дополнение к транскрипционному и сывороточному профилированию пациентов с COVID-19, неизменно выявляли уникальный и несоответствующий воспалительный ответ. Этот ответ определяется низкими уровнями интерферонов I и III типов в сравнении с повышенными хемокинами и высокой экспрессией IL-6. Предполагается, что снижение врожденной противовирусной защиты в сочетании с обильной выработкой воспалительных цитокинов являются определяющими и движущими чертами COVID-19 [33].

Заключение

Наше исследование показало, что основным морфологическим проявлением COVID-19 в миокарде является так называемый эндотелиит с дисплазией и активацией эндотелиоцитов, приводящий к кровоизлияниям, тромбозу интрамуральных артерий и некрозам. Убедительные доказательства непосредственного участия коронавируса в индукции миокардита отсутствуют, что в целом подтверждает теорию патогенеза тяжёлого течения коронавирусной инфекции, основанную на преимущественно иммунном поражении эндотелия и микротромбозах. У большинства пациентов с доказанными миокардитами мы наблюдали нарушения сердечного ритма в виде неполной блокады правой ножки пучка Гиса, полной блокады передне-верхнего разветвления левой ножки пучка Гиса, фибрилляции или экстрасистолии предсердий, у одного — желудочковую экстрасистолию (в ассоциации с острым ИМ). Не было выявлено значимых корреляций между воспалительными биомаркерами и морфологически подтвержденным миокардитом.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2020-901 от 13.11.2020).