В исследование включено 38 пациентов, среди которых было 20 пациентов с ИБС (основная группа). Группу сравнения составили 18 пациентов с некоронарогенными патологиями сердца — дегенеративные приобретенные неревматические пороки сердца (аортальный стеноз/недостаточность) и показаниями для проведения открытой операции на клапанах сердца, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Все пациенты имели показания для проведения открытого вмешательства на сердце — прямой реваскуляризации миокарда методом коронарного шунтирования или операции на клапанах сердца.

Критериями включения явились возраст пациента до 75 лет; согласие пациента на исследование. Критерии исключения: возраст пациента >75 лет; наличие сахарного диабета 1 и 2 типа в анамнезе и/ или выявленного при обследовании в период госпитализации; инфаркт миокарда (ИМ); клинически значимые сопутствующие заболевания (анемия, почечная и печеночная недостаточность, онкологические и инфекционно-воспалительные заболевания в период обострения, аутоиммунные заболевания); отказ пациента от проведения исследования.

Клинико-анамнестическая характеристика представлена таблице 1. Критерии включения для пациентов группы сравнения: верифицированный приобретенный порок сердца, согласие на проведения исследования.

Среди пациентов с ИБС преобладали лица мужского пола (60%), средний возраст которых составил 64,9 (47,8; 69,5) лет, индекс массы тела (ИМТ) — 26,4 (22,5; 30,2) кг/м2 (табл. 1). В анамнезе чаще фиксировались артериальная гипертензия, курение, стенокардия, отягощенная наследственность по сердечно-сосудистой патологии. У 14 (70%) пациентов в анамнезе был ИМ, у 2 (10%) человек — инсульт. Пациенты с приобретенными пороками сердца были сопоставимы по полу, возрасту и ИМТ с основной группой. Средний возраст пациентов составил 59,3 (43,7; 62,1) лет. Пациенты с пороками сердца чаще страдали хронической сердечной недостаточностью II-III функционального класса и имели сниженную фракцию выброса в сравнении с группой ИБС.

В течение госпитального периода все пациенты получали стандартную медикаментозную терапию в соответствии с рекомендациями Министерства Здравоохранения РФ (2020) и Европейского общества кардиологов (2020), включая гепарин, клопидогрел, аспирин, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, β-адреноблокаторы, блокаторы кальциевых каналов, нитраты, ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины). Пациенты с пороками сердца получали варфарин, β-адреноблокаторы, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, ингибиторы ГМГ-КоАредуктазы (статины), антагонисты Са (дигидропиридиновые), нитраты, диуретики.

Биоптаты ЖТ подкожной, эпикардиальной и периваскулярной локализации (3-5 г) были получены у пациентов во время оперативного вмешательства (коронарного шунтирования или коррекции пороков сердца). Источник подкожной ЖТ (ПЖТ) — подкожная клетчатка нижнего угла средостенной раны, эпикардиальной ЖТ (ЭЖТ) — зоны ее наибольшего присутствия — правые отделы сердца (правое предсердие и правый желудочек), периваскулярной ЖТ (ПВЖТ) — из области правой коронарной артерии. Образцы ЖТ подвергались криогенной заморозке жидким азотом с последующим хранением при температуре -1500 С.

Экспрессия генов ферментов синтеза церамидов пути de novo

Выделение и синтез нуклеиновых кислот. Выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК) из ЖТ проводили с помощью набора Fatty Tissue RNA Purification Kit (Norgen Biotek Corp., Канада), основным преимуществом которого является быстрое выделение и высокая степень очистки тотальной РНК из тканей с высоким содержанием липидов. Количество и чистоту выделенной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США). Для проведения обратной транскрипции и синтеза комплементарной ДНК на основе образцов РНК использовали реагенты High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (AB, США) и хранили при -200 C в течение 2 дней до момента постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Оценка генной экспрессии. Для измерения экспрессии генов ферментов синтеза церамидов пути de novo использовался метод количественной ПЦР с праймерами, синтезированными ЗАО "Евроген" (г. Москва, Россия), на амплификаторе ViiA 7 (Applied Biosystems, США). Структура праймеров представлена в таблице 2.

Для проведения ПЦР с интеркалирующим красителем SYBR Green использовали реакционную смесь мастер-микс БиоМастер UDG HS-qPCR LoROX SYBR (2×) (ООО "Биолабмикс", Россия) согласно протоколу производителя. Количественная ПЦР осуществлялась с помощью амплификатора CFX-96 Rial-Time System (Bio-Rad, США). Для расчета относительной величины экспрессии использовали метод ΔCT (вариант метода Ливака), основанный на определении разницы между значениями CT референсных генов и целевых значений CT для каждого образца. Нормирование результатов ПЦР проводилось с помощью референсных генов ACTB (β-актин), GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), B2M (бета-2-микроглобулин).

Статистический анализ

Статистический анализ полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). Данные представлены в виде медианы, 25- го и 75-го процентилей. Для анализа межгрупповых различий использовали непараметрические критерии. Сравнение 3 независимых групп проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением с применением U-критерия Манна-Уитни. Сравнение 2 независимых групп проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни. Категориальные переменные, выраженные в процентах, сравнивали с использованием критерия хиквадрат или точного критерия Фишера. Значения р<0,05 считались статистически значимыми.

Для получения информации об особенности экспрессии генов ферментов пути синтеза церамидов de novo в ЖТ были оценены уровни микро-РНК (мРНК) генов ферментов SPT, СERS и DEGS1 с использованием количественной ПЦР в реальном времени. С учетом того, что SPT состоит как минимум из двух субъединиц, был оценен уровень экспрессии мРНК SPTLC1 и мРНК SPTLC2.

Среди пациентов с ИБС обнаружена более высокая экспрессия субъединицы С1 в образцах ПЖТ и ЭЖТ в сравнении с ЖТ периваскулярной локализации (р=0,0002, р=0,010, соответственно). В отличие от субъединицы С1, уровень экспрессии субъединицы C2 был выше только в образцах ЭЖТ в сравнении с ПЖТ и ПВЖТ (р=0,012, р=0,013, соответственно) (табл. 3).

Генная экспрессия церамидсинтаз в ЖТ пациентов с ИБС имела тканевые особенности. ПЖТ характеризовалась максимальной экспрессией гена СERS2, продуцирующей длинноцепочечные церамиды С20-С24 (рис. 1), ЭЖТ — экспрессией СERS1, продуцирующей церамиды С18 и высоким уровнем мРНК СERS5, СERS5 и СERS6, генерирующих церамиды С14-С16. В ПВЖТ, аналогично ЭЖТ, выявлена максимальная экспрессия СERS4, а также СERS3, отвечающих за синтез очень длинноцепочечных церамидов С18-С20 и С26, соответственно.

Уровень мРНК DEGS1, фермента завершающей стадии синтеза церамидов, был максимальным в образцах эпикардиальной и периваскулярной ЖТ в сравнении с ПЖТ (р=0,010, р=0,012, соответственно).

В группе пациентов с пороками сердца образцы ЖТ не отличались по уровню мРНК SPTLC1, SPTLC2 и СERS1, 2, 5 и 6, в то время как отмечалась высокая экспрессия СERS3 в периваскулярных адипоцитах (р=0,004) и СERS4 в ЭЖТ (р=0,011) и ПВЖТ (р=0,024) (рис. 1). Генная экспрессия DEGS1 в образцах ЭЖТ была максимальной в сравнении с подкожными и периваскулярными адипоцитами (р=0,014 и р=0,011, соответственно) (табл. 3).

Оценка межнозологических различий в экспрессии генов ферментов пути синтеза церамидов de novo в ЖТ показала, что пациенты с ИБС, в отличие от пациентов с пороками сердца, характеризовались более высокой экспрессией SPTLC1 в ЖТ подкожной и эпикардиальной локализации (р=0,00003, р=0,0022, соответственно), SPTLC2 в образцах ЭЖТ (р=0,039) (табл. 3). Среди пациентов с ИБС также отмечалась более высокая экспрессия СERS2 в образцах всех исследуемых тканей (ПЖТ, р=0,0001, ЭЖТ, р=0,003, ПВЖТ, р=0,0013), СERS4 и 5 в эпикардиальных адипоцитах (р=0,022, р=0,017) (рис. 1). Генная экспрессия СERS6 не имела межгрупповых различий. Уровень мРНК DEGS1 среди пациентов с ИБС был выше в адипоцитах независимо от локализации (в ПЖТ, р=0,029; ЭЖТ, р=0,035; в ПВЖТ, р=0,030) (табл. 3).

Таким образом, региональные жировые депо сердца отличались по уровню экспрессии ферментов биосинтеза церамидов de novo. Полученные результаты свидетельствуют об активации синтеза церамидов по пути de novo в адипоцитах преимущественно эпикардиальной локализации при коронарогенной патологии, что может способствовать накоплению длинноцепочечных церамидов в ЖТ этой локализации.

Экспериментальные и клинические исследования показали связь между церамидами и развитием атеросклероза [17]. Особый интерес вызывает накопление церамидов в жировых депо сердца и сосудов, поскольку ЭЖТ и ПВЖТ локализованы в непосредственной близости к очагу атеросклеротического поражения. Первым этапом исследования явилась оценка экспрессии гена ключевого фермента синтеза церамидов de novo серинпальмитоилтрансферазы в ЖТ подкожной и сердечной локализации. Установлено, что у пациентов с ИБС в ЭЖТ экспрессия SPTLC1 и SPTLC2 превышала аналогичные показатели в группе пороков сердца. Максимальные значения мРНК SPTLC1 также наблюдались в группе пациентов с ИБС. Можно предположить, что при ИБС усиление экспрессии SPT, ключевого фермента пути синтеза церамидов de novo в адипоцитах ПЖТ и ЭЖТ могло быть обусловлено наличием избыточной массы тела у обследованных пациентов. Ранее проведенные клинические исследования подтверждают такую точку зрения. Так, Błachnio-Zabielska AU, et al. (2012) продемонстрировали значительное увеличение мРНК обеих субъединиц SPT (SPTLC1 и SPTLC2) в образцах ПЖТ брюшной полости у лиц с ожирением (ИМТ >30) по сравнению с контрольной группой без ожирения (ИМТ <25). Активность фермента, оцененная с использованием радиоактивно меченного субстрата, [3H]-L-серина (Moravek Biochemicals), также была повышена [18]. Однако следует принять во внимание отсутствие различий по ИМТ с группой пациентов с пороками сердца, которые имели более низкие значения экспрессии гена SPTLC1. С другой стороны, ишемия/гипоксия миокарда, обусловленная атеросклерозом коронарных артерий, могла также спровоцировать усиление экспрессии SPT в адипоцитах. Экспериментально показано, что адаптация к хронической гипоксии регулируется дифференциальным транскрипционным профилем, включающим активацию экспрессии SPT, направленным на метаболическое перепрограммирование клетки. Синтез церамидов с участием жирных кислот поначалу может носить приспособительный характер, однако по мере накопления церамидов в клетке наблюдается замедление ключевых клеточных и физиологических процессов, напротив, активируется запрограммированная гибель клетки. Важным аспектом также является индуцированное гипоксией усиление провоспалительной активности ЖТ. Считается, что гипоксия, развивающаяся в областях ЖТ, приводит к выработке адипоцитами провоспалительного фактора некроза опухоли, который, в свою очередь, усиливает экспрессию SPT [19].

Следующим этапом анализа явилась оценка профиля экспрессии генов CERS1-6, кодирующих ферменты церамидсинтазы, со специфической субстратной специфичностью по отношению к жирным кислотам с разной длиной цепи. У млекопитающих длина ацильной цепи церамида колеблется от средней (12-14С), длинной (16-20С), очень длинной (22- 26С) до сверхдлинной (>26С) цепи жирных кислот. Экспериментально показано, что активирование/ блокировка церамидсинтаз может иметь широкий спектр функциональных и тканеспецифических эффектов [20]. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что в ЖТ подкожной, эпикардиальной и периваскулярной локализации экспрессируются все 6 ферментов церамидсинтаз независимо от наличия коронарогенной или некоронарогенной нозологии. Экспрессия гена CERS4 и CERS2 была максимальной, а CERS6 самой минимальной (независимо от локализации ЖТ). Наличие коронарогенной патологии (ИБС) сопровождалось наиболее высокими значениями экспрессии СERS2 в ПЖТ, ЭЖТ, ПВЖТ, СERS4 и 5 в ЭЖТ. Имеющиеся на сегодняшний день данные экспериментальных и клинических исследований не позволяют однозначно трактовать полученные результаты. Так, отсутствует однозначное мнение о протективной или негативной роли изученных нами церамидсинтаз. Согласно данным Kim YR, et al. (2019), ингибирование экспрессии CERS4 улучшает метаболический профиль печени у мышей [21]. С другой стороны, CERS4 может генерировать С20 и С22 церамиды, обладающие защитной функцией при развитии сердечной недостаточности [22]. СERS2 синтезирует церамиды с длиной цепи С22-С24. Отличительной особенностью гена СERS2 является его организация, характерная для гена "домашнего хозяйства" и расположение в хромосомных областях, которые реплицируются на ранних стадиях клеточного цикла [23]. В физиологии клеток, в т.ч. адипоцитов, СERS2 имеет ключевое значение, поскольку нокдаун CERS2 приводит к нарушению цитокинеза [24]. Гомозиготные мыши с нокаутом CERS2 отличались высокой восприимчивостью к дезадаптивным метаболическим нарушениям при диете, вызывающей ожирение. Следует отметить, что сверхэкспрессия CERS2 была защитной при стрессовой реакции эндоплазматического ретикулума, индуцированной пальмитатом, предположительно потому, что она предотвращала индукцию CERS6, приводящую к усилению липогенеза в печени [21]. Другие исследования свидетельствуют о негативной роли CERS2. Так, избыточная экспрессия CERS2 (и накопление церамидов C20-C24) вызывает окислительный стресс и митохондриальную дисфункцию посредством липидной перегрузки, что в конечном итоге приводит к апоптозу кардиомиоцитов [25]. Некоторые авторы полагают, что CERS2-зависимое повреждение митохондрий клеток может являться объединяющим другие патологические состояния — инсулинорезистентность, окислительный стресс, усиление аутофагии и митофагии — патофизиологическим механизмом, приводящим в конечном итоге к гибели кардиомиоцитов. Показано также, что CERS2 синергично усиливает экспрессию CERS5, для которой однозначно показано участие в индукции окислительного стресса и апотоза [25]. Мыши с нулевым CERS5 жизнеспособны, фертильны, не имеют каких-либо очевидных морфологических и фенотипических изменений при нормальном питании [26]. Однако при диете с высоким содержанием жиров потеря CERS5 была ассоциирована со снижением прибавки в весе, улучшением общего состояния, уменьшением воспалительной активации белой ЖТ и снижением уровня лептина по сравнению с животными дикого типа [26].

Завершающим этапом работы была оценка экспрессии гена десатуразы, заключительного фермента пути de novo. Последняя стадия пути de novo считается не менее важной, поскольку именно церамиды, а не дигидроцерамиды, являются конечными продуктами, которые обладают разными профилями метаболической и клеточной активности. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о более высоком уровне мРНК DEGS1 в ЭЖТ у пациентов с ИБС. Ранее проведенные исследования не обнаружили подобных различий, более того, отмечена более высокая экспрессия DEGS1 в образцах ЖТ подкожных адипоцитов по сравнению с адипоцитами медиастинального депо у пациентов с избыточной массой тела (ИМТ 29,4±4,9 кг/м2, n=10), направленных на плановую операцию на аортальном клапане и/или на восходящей грудной аорте [27]. Обращает на себя внимание тот факт, что у пациентов с ИБС значения уровня мРНК DEGS1 в ПЖТ были существенно меньше, чем значения мРНК первого фермента пути de novo SPT. Напротив, значения мРНК DEGS1 в ЭЖТ были сопоставимы с экспрессией фермента SPT. Возможным объяснением избыточной экспрессии десатуразы в ЭЖТ является нивелирование патологических эффектов гипоксии, некоторые исследователи рассматривают DES1 в качестве клеточных сенсоров кислорода [28].

Таким образом, ЖТ сердца при коронарогенной патологии характеризуются активацией синтеза церамидов по пути de novo, преимущественно в эпикардиальной локализации, что может приводить к аккумуляции церамидов, потенцируя многие патологические процессы, ассоциированные с атеросклерозом. Управление биосинтезом церамидов за счет ингибирования ферментов пути de novo является привлекательной терапевтической стратегией по снижению уровня церамидов не только в плазме, но и в периферических тканях, в т.ч. в сердце и сосудах, и имеет огромные перспективы для лечения широкого спектра сердечно-сосудистых патологий.

Отношения и деятельность. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-15-20007 "Церамидный профиль локальных жировых депо сердца: клинико-патогенетическое значение и терапевтический потенциал" https://rscf.ru/project/22-15-20007/ и средств Министерства науки и высшего образования Кузбасса.